Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada desteğin devamını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan oluşturacağız.
Periferik akciğer transdüksiyonunun terapötik etkisi olmadığından, pulmoner kistik fibrozun tedavisine yönelik gen vektörlerinin iletken hava yollarına hedeflenmesi gerekir.Viral transdüksiyonun etkinliği doğrudan taşıyıcının kalma süresiyle ilgilidir.Bununla birlikte, gen taşıyıcıları gibi dağıtım sıvıları, inhalasyon sırasında doğal olarak alveollere yayılır ve herhangi bir şekildeki terapötik parçacıklar, mukosiliyer taşıma yoluyla hızla uzaklaştırılır.Gen taşıyıcılarının solunum yollarında kalma süresinin uzatılması önemli ancak başarılması zordur.Solunum yolu yüzeyine yönlendirilebilen taşıyıcıya bağlı manyetik parçacıklar bölgesel hedeflemeyi iyileştirebilir.İn vivo görüntülemedeki problemler nedeniyle, bu tür küçük manyetik parçacıkların, uygulanan bir manyetik alan varlığında hava yolu yüzeyindeki davranışı tam olarak anlaşılamamıştır.Bu çalışmanın amacı, tek ve toplu parçacıkların in vivo dinamiklerini ve davranış kalıplarını incelemek amacıyla, anestezi altındaki sıçanların trakeasındaki bir dizi manyetik parçacığın hareketini in vivo görselleştirmek için sinkrotron görüntülemeyi kullanmaktı.Daha sonra ayrıca, bir manyetik alan varlığında lentiviral manyetik parçacıkların verilmesinin, sıçan trakeasındaki iletim verimliliğini arttırıp artırmayacağını da değerlendirdik.Synchrotron X-ışını görüntüleme, manyetik parçacıkların sabit ve hareketli manyetik alanlardaki davranışlarını in vitro ve in vivo olarak gösterir.Parçacıklar, mıknatıslar kullanılarak canlı hava yollarının yüzeyi boyunca kolayca sürüklenemez, ancak taşıma sırasında birikintiler, manyetik alanın en güçlü olduğu görüş alanında yoğunlaşır.Lentiviral manyetik parçacıklar bir manyetik alan varlığında iletildiğinde iletim verimliliği de altı kat arttı.Birlikte ele alındığında bu sonuçlar, lentiviral manyetik parçacıkların ve manyetik alanların, in vivo olarak iletken hava yollarındaki gen vektörü hedefleme ve transdüksiyon seviyelerini iyileştirmek için değerli yaklaşımlar olabileceğini göstermektedir.
Kistik fibroz (CF), CF transmembran iletkenlik düzenleyici (CFTR) adı verilen tek bir gendeki varyasyonlardan kaynaklanır.CFTR proteini, kistik fibrozun patogenezinde önemli bir yer olan hava yolları da dahil olmak üzere vücuttaki birçok epitelyal hücrede bulunan bir iyon kanalıdır.CFTR'deki kusurlar anormal su taşınmasına, hava yolu yüzeyinin dehidrasyonuna ve hava yolu yüzey sıvı tabakası (ASL) derinliğinin azalmasına yol açar.Aynı zamanda mukosiliyer taşıma (MCT) sisteminin solunum yollarını solunan partiküller ve patojenlerden temizleme yeteneğini de bozar.Amacımız, CFTR geninin doğru kopyasını sunarak ASL, MCT ve akciğer sağlığını iyileştirecek bir lentiviral (LV) gen terapisi geliştirmek ve bu parametreleri in vivo olarak ölçebilecek yeni teknolojiler geliştirmeye devam etmektir1.
LV vektörleri, terapötik geni hava yolu bazal hücrelerine (hava yolu kök hücreleri) kalıcı olarak entegre edebildikleri için, kistik fibroz gen terapisinin önde gelen adaylarından biridir.Bu önemlidir, çünkü bunlar kistik fibrozis ile ilişkili fonksiyonel gen düzeltmeli hava yolu yüzey hücrelerine farklılaşarak normal hidrasyonu ve mukus klirensini geri kazanabilirler ve bu da yaşam boyu fayda sağlar.KF'de akciğer tutulumunun başladığı yer burası olduğundan LV vektörleri iletken hava yollarına doğru yönlendirilmelidir.Vektörün akciğerin daha derinlerine iletilmesi alveolar transdüksiyonla sonuçlanabilir, ancak bunun kistik fibrozda terapötik bir etkisi yoktur.Bununla birlikte, gen taşıyıcıları gibi sıvılar, doğumdan sonra solunduğunda doğal olarak alveollere göç eder3,4 ve terapötik parçacıklar, MCT'ler tarafından hızla ağız boşluğuna atılır.LV transdüksiyonunun verimliliği, vektörün hücresel alıma izin vermek için hedef hücrelere yakın kaldığı sürenin uzunluğuyla doğrudan ilişkilidir - "kalış süresi" 5, tipik bölgesel hava akışının yanı sıra mukus ve MCT parçacıklarının koordineli alımıyla kolayca kısaltılır.Kistik fibroz için, LV'nin solunum yollarında kalış süresini uzatma yeteneği, bu alanda yüksek düzeyde transdüksiyon elde etmek için önemlidir, ancak şu ana kadar bu zorlayıcı olmuştur.
Bu engelin üstesinden gelmek için LV manyetik parçacıklarının (MP'ler) iki tamamlayıcı yolla yardımcı olabileceğini öneriyoruz.Birincisi, hedeflemeyi geliştirmek ve gen taşıyıcı parçacıkların hava yolunun doğru bölgesinde olmasına yardımcı olmak için bir mıknatıs tarafından hava yolu yüzeyine yönlendirilebilirler;ve ASL) hücre katmanı 6'ya geçer. MP'ler, antikorlara, kemoterapi ilaçlarına veya hücre zarlarına bağlanan veya ilgili hücre yüzeyi reseptörlerine bağlanan ve tümör bölgelerinde biriken diğer küçük moleküllere bağlandıklarında hedeflenen ilaç dağıtım araçları olarak yaygın şekilde kullanılır. Statik elektriğin varlığı.Kanser tedavisi için manyetik alanlar 7. Diğer “hipertermik” yöntemler, salınımlı manyetik alanlara maruz kaldıklarında MP'leri ısıtarak tümör hücrelerini öldürmeyi amaçlamaktadır.DNA'nın hücrelere transferini arttırmak için bir transfeksiyon ajanı olarak bir manyetik alanın kullanıldığı manyetik transfeksiyon ilkesi, transdüksiyonu zor hücre çizgileri için bir dizi viral olmayan ve viral gen vektörleri kullanılarak in vitro olarak yaygın olarak kullanılır. ..LV manyetotransfeksiyonunun, LV MP'nin in vitro olarak insan bronş epitelinin bir hücre hattına statik bir manyetik alan varlığında verilmesiyle etkinliği belirlendi; bu, tek başına LV vektörüyle karşılaştırıldığında transdüksiyonun verimliliğini 186 kat artırdı.LV MT aynı zamanda kistik fibrozun in vitro modeline de uygulanmıştır; burada manyetik transfeksiyon, kistik fibroz balgamının varlığında hava-sıvı arayüz kültürlerinde LV transdüksiyonunu 20 kat arttırmıştır10.Bununla birlikte, in vivo organ manyetotransfeksiyonu nispeten az ilgi görmüştür ve yalnızca birkaç hayvan çalışmasında11,12,13,14,15, özellikle akciğerlerde16,17 değerlendirilmiştir.Ancak kistik fibrozda akciğer tedavisinde manyetik transfeksiyon olasılıkları açıktır.Tan ve ark.(2020) "manyetik nanopartiküllerin akciğerlere etkili bir şekilde verilmesine ilişkin bir doğrulama çalışmasının, kistik fibrozisli hastalarda klinik sonuçları iyileştirmek için gelecekteki CFTR inhalasyon stratejilerinin önünü açacağını" belirtti.
Uygulanan bir manyetik alan varlığında solunum yolu yüzeyindeki küçük manyetik parçacıkların davranışının görselleştirilmesi ve incelenmesi zordur ve bu nedenle yeterince anlaşılmamıştır.Diğer çalışmalarda, gaz kanalı yüzey hidrasyonunu doğrudan ölçmek için, invazif olmayan görüntüleme ve ASL18 derinliği ve MCT19 davranışındaki20 dakikadaki in vivo değişikliklerin miktarının belirlenmesi için bir Senkrotron Yayılım Tabanlı Faz Kontrastlı X-Işını Görüntüleme (PB-PCXI) yöntemi geliştirdik. ve tedavi etkinliğinin erken göstergesi olarak kullanılır.Ek olarak, MCT puanlama yöntemimiz, PB-PCXI21 ile görülebilen MCT belirteçleri olarak alümina veya yüksek kırılma indeksli camdan oluşan 10-35 µm çaplı parçacıklar kullanır.Her iki yöntem de MP'ler de dahil olmak üzere çeşitli parçacık türlerinin görüntülenmesi için uygundur.
Yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük nedeniyle, PB-PCXI tabanlı ASL ve MCT analizlerimiz, MP gen dağıtım yöntemlerini anlamamıza ve optimize etmemize yardımcı olmak için tekli ve toplu parçacıkların dinamiklerini ve davranış modellerini in vivo olarak incelemek için çok uygundur.Burada kullandığımız yaklaşım, gözlemlenen heterojen gen ekspresyon modellerimizi açıklamaya yardımcı olmak için farelerin nazal ve pulmoner solunum yollarına bir doz kukla vektörün verilmesini takiben sıvı hareketini görselleştirdiğimiz SPring-8 BL20B2 ışın hattını kullanan çalışmalarımıza dayanmaktadır. genimizde.3.4 taşıyıcı dozuyla yapılan hayvan çalışmaları.
Bu çalışmanın amacı, canlı sıçanların trakeasındaki bir dizi MP'nin in vivo hareketlerini görselleştirmek için PB-PCXI senkrotronunu kullanmaktı.Bu PB-PCXI görüntüleme çalışmaları, MP serisini, manyetik alan gücünü ve konumunu test ederek bunların MP hareketi üzerindeki etkilerini belirlemek üzere tasarlanmıştır.Harici bir manyetik alanın iletilen MF'nin hedef bölgede kalmasına veya hareket etmesine yardımcı olacağını varsaydık.Bu çalışmalar aynı zamanda birikimden sonra trakeada kalan parçacık miktarını maksimuma çıkaran mıknatıs konfigürasyonlarını belirlememize de olanak sağladı.İkinci bir çalışma serisinde, LV-MP'lerin hava yolu hedefleme bağlamında verilmesinin sonuç vereceği varsayımıyla, LV-MP'lerin sıçan hava yollarına in vivo verilmesinden kaynaklanan transdüksiyon modelini göstermek için bu optimal konfigürasyonu kullanmayı amaçladık. artan LV iletim verimliliğinde..
Tüm hayvan çalışmaları, Adelaide Üniversitesi (M-2019-060 ve M-2020-022) ve SPring-8 Synchrotron Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi.Deneyler ARRIVE'ın tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
Tüm x-ışını görüntüleri Japonya'daki SPring-8 senkrotronunda BL20XU ışın hattında daha önce21,22açıklanana benzer bir kurulum kullanılarak alınmıştır.Kısaca, deney kutusu senkrotron depolama halkasından 245 m uzağa yerleştirildi.Faz kontrast efektleri oluşturmak için parçacık görüntüleme çalışmaları için 0,6 m ve in vivo görüntüleme çalışmaları için 0,3 m'lik bir numune-dedektör mesafesi kullanılır.25 keV enerjiye sahip monokromatik bir ışın kullanıldı.Görüntüler, bir sCMOS dedektörüne bağlı yüksek çözünürlüklü bir X-ışını dönüştürücüsü (SPring-8 BM3) kullanılarak elde edildi.Dönüştürücü, 10 µm kalınlığında bir sintilatör (Gd3Al2Ga3O12) kullanarak X ışınlarını görünür ışığa dönüştürür ve bu daha sonra bir ×10 (NA 0,3) mikroskop hedefi kullanılarak sCMOS sensörüne yönlendirilir.SCMOS dedektörü, dizi boyutu 2048 x 2048 piksel ve ham piksel boyutu 6,5 x 6,5 µm olan bir Orca-Flash4.0'dır (Hamamatsu Photonics, Japonya).Bu ayar, 0,51 µm'lik etkin izotropik piksel boyutu ve yaklaşık 1,1 mm × 1,1 mm'lik bir görüş alanı sağlar.100 ms'lik maruz kalma süresi, hava yollarının içindeki ve dışındaki manyetik parçacıkların sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarırken nefes almanın neden olduğu hareket artefaktlarını en aza indirmek için seçildi.İn vivo çalışmalar için, X-ışını ışınını maruz kalmalar arasında bloke ederek radyasyon dozunu sınırlamak için X-ışını yoluna hızlı bir X-ışını deklanşörü yerleştirildi.
BL20XU görüntüleme odası Biyogüvenlik Düzeyi 2 sertifikalı olmadığından LV ortamı herhangi bir SPring-8 PB-PCXI görüntüleme çalışmasında kullanılmamıştır.Bunun yerine, iki ticari satıcıdan çeşitli boyutları, malzemeleri, demir konsantrasyonlarını ve uygulamaları kapsayan, iyi karakterize edilmiş bir dizi MP'yi seçtik. İlk önce manyetik alanların cam kılcal damarlardaki MP'lerin hareketini nasıl etkilediğini anlamak için, sonra da yaşayan hava yollarıyüzey.MP'nin boyutu 0,25 ila 18 µm arasında değişir ve çeşitli malzemelerden yapılır (bkz. Tablo 1), ancak MP'deki manyetik parçacıkların boyutu da dahil olmak üzere her numunenin bileşimi bilinmemektedir.Kapsamlı MCT çalışmalarımıza (19, 20, 21, 23, 24) dayanarak, örneğin MP hareketinin daha iyi görünürlüğünü görmek için ardışık kareleri çıkararak trakeal hava yolu yüzeyinde 5 µm'ye kadar MP'lerin görülebilmesini bekliyoruz.0,25 µm'lik tek bir MP, görüntüleme cihazının çözünürlüğünden daha küçüktür, ancak PB-PCXI'nin hacimsel kontrastlarını ve biriktirildikten sonra üzerine biriktikleri yüzey sıvısının hareketini algılaması beklenir.
Tablodaki her MP için örnekler.1, iç çapı 0,63 mm olan 20 ul cam kılcal damarlarda (Drummond Microcaps, PA, ABD) hazırlandı.Korpüsküler parçacıklar suda mevcutken, CombiMag parçacıkları üreticinin tescilli sıvısında mevcuttur.Her tüpün yarısı sıvıyla (yaklaşık 11 µl) doldurulur ve numune tutucuya yerleştirilir (bkz. Şekil 1).Cam kılcal damarlar görüntüleme odasındaki sahneye sırasıyla yatay olarak yerleştirildi ve sıvının kenarlarına yerleştirildi.Nadir toprak, neodim, demir ve bordan (NdFeB) (N35, kat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Avustralya) yapılmış, 1,17 T kalıntıya sahip 19 mm çapında (28 mm uzunluğunda) nikel kabuklu bir mıknatıs, bir İşleme sırasında konumunuzu uzaktan değiştirmek için ayrı aktarım tablosu.X-ışını görüntüleme, mıknatıs numunenin yaklaşık 30 mm yukarısına yerleştirildiğinde başlar ve görüntüler saniyede 4 kare hızında elde edilir.Görüntüleme sırasında mıknatıs, cam kılcal tüpe yaklaştırıldı (yaklaşık 1 mm mesafede) ve ardından alan kuvvetinin ve konumun etkisini değerlendirmek için tüp boyunca hareket ettirildi.
Xy örneğinin çevrilmesi aşamasında cam kılcal damarlarda MP örnekleri içeren bir in vitro görüntüleme düzeni.X-ışını ışınının yolu kırmızı noktalı çizgiyle işaretlenmiştir.
MP'lerin in vitro görünürlüğü belirlendikten sonra bunların bir alt kümesi, vahşi tip dişi Wistar albino sıçanlarında (~12 haftalık, ~200 g) in vivo olarak test edildi.Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japonya), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonya) ve butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Sıçanlara Pharma (Japonya) karışımı ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla anestezi uygulandı.Anestezinin ardından trakea çevresindeki kürkün alınması, endotrakeal tüp (ET; 16 Ga intravenöz kanül, Terumo BCT) yerleştirilmesi ve termal torba içeren özel yapım görüntüleme plakası üzerinde sırtüstü pozisyonda hareketsiz hale getirilmesiyle görüntüleme için hazırlandılar. vücut ısısını korumak için.22. Görüntüleme plakası daha sonra, Şekil 2a'da gösterildiği gibi trakeayı x-ışını görüntüsü üzerinde yatay olarak hizalamak için görüntüleme kutusundaki numune aşamasına hafif bir açıyla takıldı.
(a) SPring-8 görüntüleme ünitesindeki in vivo görüntüleme kurulumu, X-ışını ışını yolu kırmızı noktalı çizgiyle işaretlenmiştir.(b,c) Trakeal mıknatıs lokalizasyonu, ortogonal olarak monte edilmiş iki IP kamera kullanılarak uzaktan gerçekleştirildi.Ekrandaki görüntünün sol tarafında, kafayı tutan tel halkayı ve ET tüpünün içine yerleştirilmiş dağıtım kanülünü görebilirsiniz.
100 ul'lik bir cam şırınga kullanan uzaktan kumandalı bir şırınga pompası sistemi (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), 30 Ga'lık bir iğne kullanılarak bir PE10 tüpüne (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) bağlandı.Endotrakeal tüpü yerleştirirken ucun trakeada doğru pozisyonda olduğundan emin olmak için tüpü işaretleyin.Bir mikro pompa kullanılarak şırınga pistonu çıkarıldı ve tüpün ucu, iletilecek MP numunesine daldırıldı.Yüklenen dağıtım tüpü daha sonra endotrakeal tüpün içine yerleştirildi ve uç, beklenen uygulamalı manyetik alanımızın en güçlü kısmına yerleştirildi.Görüntü alımı, Arduino tabanlı zamanlama kutumuza bağlı bir nefes dedektörü kullanılarak kontrol edildi ve tüm sinyaller (örn. sıcaklık, solunum, deklanşör açma/kapama ve görüntü edinme) Powerlab ve LabChart (AD Instruments, Sidney, Avustralya) kullanılarak kaydedildi. 22 Görüntüleme Sırasında Muhafaza kullanılamadığında, iki IP kamera (Panasonic BB-SC382) birbirine yaklaşık 90° açıyla yerleştirildi ve görüntüleme sırasında mıknatısın trakeaya göre konumunu kontrol etmek için kullanıldı (Şekil 2b, c).Hareket artefaktlarını en aza indirmek için, terminal solunum akışı platosu sırasında nefes başına bir görüntü elde edildi.
Mıknatıs, görüntüleme gövdesinin dışına uzaktan yerleştirilebilen ikinci aşamaya bağlanır.Mıknatısın çeşitli konumları ve konfigürasyonları test edilmiştir; bunlar arasında şunlar yer almaktadır: trakeanın yaklaşık 30° yukarısında bir açıyla yerleştirilmiş (konfigürasyonlar Şekil 2a ve 3a'da gösterilmektedir);kutupları çekim için ayarlanmış şekilde bir mıknatıs hayvanın üstünde ve diğeri alttadır (Şekil 3b)., kutupları itme için ayarlanmış şekilde (Şekil 3c) hayvanın üstünde ve altında bir mıknatıs ve trakeaya dik ve üstünde bir mıknatıs (Şekil 3d).Hayvanı ve mıknatısı ayarladıktan ve test altındaki MP'yi şırınga pompasına yükledikten sonra, görüntülerin alınması üzerine 4 ul/sn hızında 50 ul'lik bir doz verin.Daha sonra mıknatıs, görüntü almaya devam ederken trakea boyunca veya boyunca ileri geri hareket ettirilir.
İn vivo görüntüleme için mıknatıs konfigürasyonu (a) trakeanın üzerinde yaklaşık 30°'lik bir açıyla bir mıknatıs, (b) çekim için yapılandırılmış iki mıknatıs, (c) itme için yapılandırılmış iki mıknatıs, (d) trakeanın üstünde ve dik olan bir mıknatıs soluk borusu.Gözlemci soluk borusu yoluyla ağızdan akciğerlere baktı ve X-ışını ışını farenin sol tarafından geçip sağ taraftan çıktı.Mıknatıs ya hava yolu boyunca hareket ettirilir ya da X-ışını yönünde trakeanın sağına ve soluna doğru hareket ettirilir.
Ayrıca solunum ve kalp atış hızının karışmadığı durumlarda solunum yollarındaki parçacıkların görünürlüğünü ve davranışını belirlemeye çalıştık.Bu nedenle, görüntüleme periyodunun sonunda pentobarbital doz aşımı nedeniyle hayvanlara insanca ötenazi uygulandı (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, ABD; ~65 mg/kg ip).Bazı hayvanlar görüntüleme platformunda bırakıldı ve nefes alma ve kalp atışı durduktan sonra görüntüleme işlemi tekrarlandı ve hava yolu yüzeyinde MP görünmüyorsa ek bir MP dozu eklendi.
Ortaya çıkan görüntüler düz ve karanlık alan için düzeltildi ve ardından MATLAB'da yazılmış özel bir komut dosyası (R2020a, The Mathworks) kullanılarak bir filme (saniyede 20 kare; solunum hızına bağlı olarak 15-25 x normal hız) birleştirildi.
LV gen vektörü dağıtımına ilişkin tüm çalışmalar, Adelaide Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Araştırma Merkezi'nde gerçekleştirildi ve bir manyetik alan varlığında LV-MP dağıtımının in vivo gen transferini geliştirip geliştiremeyeceğini değerlendirmek için SPring-8 deneyinin sonuçlarını kullanmayı amaçladı. .MF ve manyetik alanın etkilerini değerlendirmek için iki grup hayvan tedavi edildi: bir gruba mıknatıs yerleştirmeli LV MF enjekte edildi ve diğer gruba mıknatıssız LV MF kontrol grubu enjekte edildi.
LV gen vektörleri daha önce açıklanan yöntemler 25, 26 kullanılarak oluşturulmuştur.LacZ vektörü, MPSV kurucu promoteri (LV-LacZ) tarafından yönlendirilen nükleer lokalize bir beta-galaktosidaz genini eksprese eder; bu, transdüksiyona tabi tutulmuş hücrelerde, akciğer dokusunun ön kısımlarında ve bölümlerinde görülebilen mavi bir reaksiyon ürünü üretir.Titrasyon, TU/ml cinsinden titreyi hesaplamak için bir hemasitometre kullanılarak LacZ-pozitif hücrelerin sayısı manuel olarak sayılarak hücre kültürlerinde gerçekleştirildi.Taşıyıcılar -80°C'de dondurulur, kullanılmadan önce eritilir ve 1:1 karıştırılarak ve teslimattan önce en az 30 dakika buz üzerinde inkübe edilerek CombiMag'e bağlanır.
Normal Sprague Dawley sıçanları (n = 3/grup, ~2-3, 1 aylıkken 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Avustralya) ve 60 mg/kg ketamin (Ilium, Avustralya) karışımıyla ip ile anestezi uygulanmış) ip ) enjeksiyon ve 16 Ga intravenöz kanül ile cerrahi olmayan oral kanülasyon.Trakeal hava yolu dokusunun LV transdüksiyonunu aldığından emin olmak için, trakeal hava yolu yüzeyinin bir tel sepet (N-Circle, uçsuz nitinol taş çıkarıcı NTSE-022115) ile eksenel olarak ovulduğu daha önce tarif edilen mekanik pertürbasyon protokolümüz kullanılarak koşullandırıldı -UDH, Cook Medical, ABD) 30 s28.Daha sonra biyogüvenlik kabinindeki tedirginlikten yaklaşık 10 dakika sonra LV-MP'nin trakeal uygulaması gerçekleştirildi.
Bu deneyde kullanılan manyetik alan, in vivo röntgen çalışmasına benzer şekilde yapılandırıldı; aynı mıknatıslar damıtma stent kelepçeleriyle trakea üzerinde tutuldu (Şekil 4).Daha önce açıklandığı gibi jel uçlu bir pipet kullanılarak trakeaya (n = 3 hayvan) 50 ul hacim (2 x 25 ul alikotlar) LV-MP verildi.Kontrol grubu (n = 3 hayvan), mıknatıs kullanılmadan aynı LV-MP'yi aldı.İnfüzyonun tamamlanmasından sonra kanül endotrakeal tüpten çıkarılır ve hayvan ekstübe edilir.Mıknatıs çıkarılmadan önce 10 dakika boyunca yerinde kalır.Sıçanlara deri altından meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Avustralya) uygulandı ve ardından 1 mg/kg atipamazol hidroklorürün (Antisedan, Zoetis, Avustralya) intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla anestezi geri çekildi.Sıçanlar sıcak tutuldu ve anesteziden tamamen iyileşene kadar gözlemlendi.
Biyolojik güvenlik kabinindeki LV-MP dağıtım cihazı.ET tüpünün açık gri Luer-lock manşonunun ağızdan dışarı çıktığını ve şekilde gösterilen jel pipet ucunun ET tüpünün içinden trakeaya istenilen derinliğe kadar sokulduğunu görebilirsiniz.
LV-MP uygulama prosedüründen bir hafta sonra hayvanlar, %100 CO2 solunarak insani bir şekilde kurban edildi ve LacZ ekspresyonu, standart X-gal tedavimiz kullanılarak değerlendirildi.Endotrakeal tüp yerleşimine bağlı herhangi bir mekanik hasarın veya sıvı tutulmasının analize dahil edilmemesini sağlamak için en kaudaldeki üç kıkırdak halkası çıkarıldı.Her trakea, analiz için iki yarım elde etmek amacıyla uzunlamasına kesildi ve lümen yüzeyini görselleştirmek için bir Minutien iğnesi (Fine Science Tools) kullanılarak silikon kauçuk içeren bir kaba (Sylgard, Dow Inc) yerleştirildi.Dönüştürülmüş hücrelerin dağılımı ve karakteri, DigiLite kamera ve TCapture yazılımı (Tucsen Photonics, Çin) ile bir Nikon mikroskobu (SMZ1500) kullanılarak önden fotoğraflama ile doğrulandı.Görüntüler 20x büyütmede (trakeanın tam genişliği için maksimum ayar dahil) elde edildi; trakeanın tüm uzunluğu adım adım görüntülendi ve görüntülerin "dikilmesine" olanak sağlamak için her görüntü arasında yeterli örtüşme sağlandı.Daha sonra her bir trakeadan alınan görüntüler, düzlemsel hareket algoritması kullanılarak Composite Image Editor sürüm 2.0.3 (Microsoft Research) kullanılarak tek bir kompozit görüntü halinde birleştirildi. Her hayvandan alınan trakeal kompozit görüntüler içindeki LacZ ifadesinin alanı, daha önce açıklandığı gibi28 otomatik bir MATLAB komut dosyası (R2020a, MathWorks) kullanılarak, 0,35 < Ton < 0,58, Doygunluk > 0,15 ve Değer < 0,7 ayarları kullanılarak ölçüldü. Her hayvandan alınan trakeal kompozit görüntüler içindeki LacZ ifadesinin alanı, daha önce açıklandığı gibi28 otomatik bir MATLAB komut dosyası (R2020a, MathWorks) kullanılarak, 0,35 < Ton < 0,58, Doygunluk > 0,15 ve Değer < 0,7 ayarları kullanılarak ölçüldü. LacZ'in, dünyanın en iyi okullarından biri olan şehirlerarası yolculukları gerçekleştirmesi пользованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, спользованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, н асыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Her bir hayvanın kompozit trakeal görüntülerindeki LacZ ifadesinin alanı, daha önce açıklandığı gibi28 0,35'lik ayarlar kullanılarak otomatik bir MATLAB komut dosyası (R2020a, MathWorks) kullanılarak ölçüldü.0,15 ve değer<0 ,7.MATLAB 脚本（R2020a, MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。 .................... BELKİ LacZ'in en iyi alışverişi, en iyi şekilde gerçekleştirilebilecek bir alışveriş merkezidir. ием автоматизированного MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованного настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщеннос ть> 0,15 ve значение <0,7 . Her hayvanın trakeasının kompozit görüntülerindeki LacZ ifadesinin alanları, daha önce 0,35 < renk tonu < 0,58, doygunluk > 0,15 ve değer < 0,7 ayarları kullanılarak açıklandığı gibi otomatik bir MATLAB komut dosyası (R2020a, MathWorks) kullanılarak ölçüldü.GIMP v2.10.24'te doku konturları takip edilerek, doku alanını tanımlamak ve trakeal doku dışındaki yanlış tespitleri önlemek amacıyla her kompozit görüntü için manuel olarak bir maske oluşturuldu.Her bir hayvanın tüm kompozit görüntülerinin lekeli alanları, o hayvanın toplam lekeli alanını verecek şekilde toplandı.Boyalı alan daha sonra normalleştirilmiş bir alan elde etmek için maskenin toplam alanına bölündü.
Her trakea parafine gömüldü ve 5 µm kalınlığında kesitlere ayrıldı.Kesitler, 5 dakika boyunca nötr hızlı kırmızı ile zıt boyandı ve görüntüler, bir Nikon Eclipse E400 mikroskobu, DS-Fi3 kamera ve NIS eleman yakalama yazılımı (versiyon 5.20.00) kullanılarak elde edildi.
Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism v9'da (GraphPad Software, Inc.) yapıldı.İstatistiksel anlamlılık p ≤ 0,05 olarak belirlendi.Normallik, Shapiro-Wilk testi kullanılarak test edildi ve LacZ boyamasındaki farklılıklar, eşleştirilmemiş bir t testi kullanılarak değerlendirildi.
Tablo 1'de açıklanan altı MP, PCXI ile incelendi ve görünürlük Tablo 2'de açıklandı. İki polistiren MP (sırasıyla MP1 ve MP2; 18 µm ve 0,25 µm) PCXI tarafından görülemedi ancak geri kalan numuneler tanımlanabildi. (örnekler Şekil 5'te gösterilmektedir).MP3 ve MP4 zayıf bir şekilde görülebilmektedir (sırasıyla %10-15 Fe3O4; 0,25 µm ve 0,9 µm).MP5 (%98 Fe3O4; 0,25 µm) test edilen en küçük parçacıklardan bazılarını içermesine rağmen en belirgin olanıydı.CombiMag MP6 ürününü ayırt etmek zordur.Her durumda, mıknatısı kılcal damara paralel olarak ileri geri hareket ettirerek MF'leri tespit etme yeteneğimiz büyük ölçüde geliştirildi.Mıknatıslar kılcal damardan uzaklaştıkça parçacıklar uzun zincirler halinde dışarı çekildi, ancak mıknatıslar yaklaştıkça ve manyetik alan gücü arttıkça parçacık zincirleri, parçacıklar kılcal damarın üst yüzeyine doğru göç ederken kısaldı (bkz. Ek Video S1). : MP4), yüzeydeki parçacık yoğunluğunu arttırır.Tersine, mıknatıs kılcal damardan çıkarıldığında alan gücü azalır ve MP'ler kılcal damarın üst yüzeyinden uzanan uzun zincirler halinde yeniden düzenlenir (bkz. Ek Video S2: MP4).Mıknatısın hareketi durduktan sonra parçacıklar denge konumuna ulaştıktan sonra bir süre daha hareket etmeye devam ederler.MP kılcalın üst yüzeyine doğru ve uzaklaştıkça, manyetik parçacıklar sıvının içinden döküntüleri çekme eğilimindedir.
PCXI altında MP'nin görünürlüğü örnekler arasında önemli ölçüde farklılık gösterir.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ve (d) MP6.Burada gösterilen tüm görüntüler kılcal damarın yaklaşık 10 mm yukarısına konumlandırılmış bir mıknatısla çekilmiştir.Görünen büyük daireler, kılcal damarlarda hapsolmuş hava kabarcıklarıdır ve faz kontrast görüntüsünün siyah ve beyaz kenar özelliklerini açıkça göstermektedir.Kırmızı kutu kontrastı artıran büyütmeyi gösterir.Tüm şekillerdeki mıknatıs devrelerinin çaplarının ölçekli olmadığını ve gösterilenden yaklaşık 100 kat daha büyük olduğunu unutmayın.
Mıknatıs kılcal damarın üst kısmı boyunca sola ve sağa hareket ettikçe, MP dizisinin açısı mıknatısla aynı hizada olacak şekilde değişir (bkz. Şekil 6), böylece manyetik alan çizgileri belirlenir.MP3-5 için kiriş eşik açısına ulaştıktan sonra parçacıklar kılcal damarın üst yüzeyi boyunca sürüklenir.Bu genellikle MP'lerin manyetik alanın en güçlü olduğu yerin yakınında daha büyük gruplar halinde kümelenmesiyle sonuçlanır (bkz. Ek Video S3: MP5).Bu aynı zamanda MP'nin sıvı-hava arayüzünde toplanmasına ve konsantre olmasına neden olan kılcal damarın ucuna yakın görüntüleme yapılırken özellikle belirgindir.MP6'daki, MP3-5'tekilere göre ayırt edilmesi daha zor olan parçacıklar, mıknatıs kılcal damar boyunca hareket ettiğinde sürüklenmedi, ancak MP dizileri ayrışarak parçacıkları görünürde bıraktı (bkz. Ek Video S4: MP6).Bazı durumlarda, uygulanan manyetik alan, mıknatısın görüntüleme alanından uzun bir mesafeye hareket ettirilmesiyle azaltıldığında, kalan MP'ler, ipin içinde kalarak yerçekimi ile yavaşça tüpün alt yüzeyine indi (bkz. Ek Video S5: MP3) .
Mıknatıs kılcal damarın üzerinde sağa doğru hareket ettikçe MP dizisinin açısı değişir.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ve (d) MP6.Kırmızı kutu kontrastı artıran büyütmeyi gösterir.Ek videoların, bu statik görüntülerde görselleştirilemeyen önemli parçacık yapısını ve dinamik bilgileri ortaya çıkarması nedeniyle bilgilendirme amaçlı olduğunu lütfen unutmayın.
Testlerimiz, mıknatısın trakea boyunca yavaşça ileri geri hareket ettirilmesinin, in vivo karmaşık hareket bağlamında MF'nin görselleştirilmesini kolaylaştırdığını göstermiştir.Polistiren boncuklar (MP1 ve MP2) kılcal damarda görünmediğinden in vivo testler yapılmadı.Geriye kalan dört MF'nin her biri, mıknatısın uzun ekseni trakea üzerinde dikeyle yaklaşık 30°'lik bir açıyla konumlandırılarak in vivo olarak test edildi (bkz. Şekil 2b ve 3a), çünkü bu daha uzun MF zincirleriyle sonuçlandı ve daha etkili oldu. bir mıknatıstan daha fazlası..yapılandırma sonlandırıldı.Hiçbir canlı hayvanın soluk borusunda MP3, MP4 ve MP6'ya rastlanmamıştır.Hayvanları insani bir şekilde öldürdükten sonra farelerin solunum yollarını görselleştirirken, bir şırınga pompası kullanılarak ilave hacim eklense bile parçacıklar görünmez kaldı.MP5 en yüksek demir oksit içeriğine sahipti ve görünür tek parçacıktı, dolayısıyla MP davranışını in vivo olarak değerlendirmek ve karakterize etmek için kullanıldı.
MF yerleştirme sırasında mıknatısın trakea üzerine yerleştirilmesi, MF'lerin hepsinin olmasa da çoğunun görüş alanında yoğunlaşmasına neden oldu.Parçacıkların trakeal girişi en iyi şekilde insanca ötenazi yapılan hayvanlarda gözlemlenir.Şekil 7 ve Ek Video S6: MP5, ventral trakea yüzeyindeki parçacıkların hızlı manyetik yakalanmasını ve hizalanmasını gösterir; bu, MP'lerin trakeanın istenen alanlarına hedeflenebileceğini gösterir.MF iletiminden sonra trakea boyunca daha distalde arama yapılırken, karinaya daha yakın bazı MF'ler bulundu; bu, sıvı uygulaması sırasında maksimum manyetik alan kuvveti bölgesinden iletildikleri için tüm MF'leri toplamak ve tutmak için yetersiz manyetik alan kuvvetine işaret eder.işlem.Bununla birlikte, doğum sonrası MP konsantrasyonlarının görüntü alanı çevresinde daha yüksek olması, birçok MP'nin, uygulanan manyetik alan kuvvetinin en yüksek olduğu hava yolu bölgelerinde kaldığını düşündürmektedir.
Görüntüleme alanının hemen üzerine yerleştirilmiş bir mıknatısla MP5'in yakın zamanda ötenazi uygulanan bir sıçanın trakeasına verilmesinden önce (a) ve (b) sonrasının görüntüleri.Gösterilen alan iki kıkırdaklı halka arasında yer almaktadır.MP doğmadan önce hava yollarında bir miktar sıvı var.Kırmızı kutu kontrastı artıran büyütmeyi gösterir.Bu görüntüler S6: MP5 Tamamlayıcı Video'da yer alan videodan alınmıştır.
Mıknatısın in vivo olarak trakea boyunca hareket ettirilmesi, kılcal damarlarda gözlemlenene benzer şekilde hava yolu yüzeyindeki MP zincirinin açısında bir değişiklikle sonuçlandı (bkz. Şekil 8 ve Ek Video S7: MP5).Ancak çalışmamızda MP'ler kılcal damarların yapabildiği gibi canlı solunum yollarının yüzeyi boyunca sürüklenemedi.Bazı durumlarda mıknatıs sola ve sağa hareket ettikçe MP zinciri uzar.İlginç bir şekilde, mıknatıs trakea boyunca uzunlamasına hareket ettirildiğinde parçacık zincirinin sıvının yüzey katmanının derinliğini değiştirdiğini ve mıknatıs doğrudan yukarı doğru hareket ettirildiğinde ve parçacık zinciri dikey konuma döndürüldüğünde genişlediğini de bulduk (bkz. Ek Video S7).: 0:09'da MP5, sağ altta).Mıknatıs trakeanın üst kısmı boyunca yanal olarak (yani trakea uzunluğu boyunca değil, hayvanın soluna veya sağına doğru) hareket ettirildiğinde karakteristik hareket modeli değişti.Parçacıklar hareketleri sırasında hala açıkça görülebiliyordu, ancak mıknatıs trakeadan çıkarıldığında parçacık dizilerinin uçları görünür hale geldi (bakınız Ek Video S8: MP5, 0:08'den başlıyor).Bu, bir cam kılcal damarda uygulanan manyetik alanın etkisi altında manyetik alanın gözlemlenen davranışına uygundur.
Canlı anestezi uygulanmış bir sıçanın trakeasındaki MP5'i gösteren örnek görüntüler.(a) Mıknatıs, trakeanın üstünde ve solunda görüntü elde etmek için kullanılır, ardından (b) mıknatısı sağa hareket ettirdikten sonra kullanılır.Kırmızı kutu kontrastı artıran büyütmeyi gösterir.Bu görüntüler S7'nin Ek Videosu: MP5'te yer alan videodan alınmıştır.
İki kutup trakeanın üstünde ve altında kuzey-güney yöneliminde ayarlandığında (yani çekici; Şekil 3b), MP akorları daha uzun göründü ve trakeanın dorsal yüzeyinden ziyade trakeanın yan duvarında konumlandı. trakea (bkz. Ek).Video S9:MP5).Bununla birlikte, genellikle tek mıknatıslı bir cihazla meydana gelen çift mıknatıslı bir cihaz kullanılarak yapılan sıvı uygulamasından sonra bir bölgede (yani trakeanın dorsal yüzeyi) yüksek partikül konsantrasyonları tespit edilmedi.Daha sonra, bir mıknatıs zıt kutupları itecek şekilde yapılandırıldığında (Şekil 3c), görüş alanında görünen parçacıkların sayısı teslimattan sonra artmadı.Mıknatısları sırasıyla çeken veya iten yüksek manyetik alan kuvveti nedeniyle her iki mıknatıs konfigürasyonunu ayarlamak zordur.Daha sonra kurulum, hava yollarına paralel ancak hava yollarından 90 derecelik bir açıyla geçen tek bir mıknatısa dönüştürüldü, böylece kuvvet çizgileri trakea duvarını dik olarak geçti (Şekil 3d), bu yönlendirme, üzerinde parçacık toplanması olasılığını belirlemek için tasarlanmıştır. yan duvar.gözlemlenmelidir.Ancak bu konfigürasyonda tanımlanabilir bir MF birikim hareketi veya mıknatıs hareketi yoktu.Tüm bu sonuçlara dayanarak, gen taşıyıcılarının in vivo çalışmaları için tek mıknatıslı ve 30 derecelik yönelimli bir konfigürasyon seçildi (Şekil 3a).
Hayvan, insani bir şekilde kurban edildikten hemen sonra birçok kez görüntülendiğinde, müdahale eden doku hareketinin olmaması, mıknatısın öteleme hareketine uygun olarak 'sallanan' açık kıkırdaklararası alanda daha ince, daha kısa parçacık çizgilerinin fark edilebileceği anlamına geliyordu.MP6 parçacıklarının varlığını ve hareketini açıkça görün.
LV-LacZ titresi 1,8 x 108 IU/mL idi ve CombiMag MP (MP6) ile 1:1 karıştırıldıktan sonra hayvanlara 9 x 107 IU/ml LV aracından (yani 4,5) 50 ul trakeal doz enjekte edildi. x 106 TU/sıçan).)).Bu çalışmalarda, doğum sırasında mıknatısı hareket ettirmek yerine, mıknatısı bir pozisyonda sabitleyerek (a) manyetik alan yokluğunda vektör iletimi ile karşılaştırıldığında SlV iletiminin iyileştirilip iyileştirilemeyeceğini ve (b) hava yolunun daha iyi hale getirilip getirilemeyeceğini belirledik. odaklanmak.Hücreler üst solunum yolunun manyetik hedef bölgelerine aktarılıyor.
Mıknatısların varlığı ve CombiMag'in LV vektörleriyle kombinasyon halinde kullanılması, standart LV vektör dağıtım protokolümüzde olduğu gibi hayvan sağlığını olumsuz yönde etkilememiş gibi görünmektedir.Mekanik bozulmaya maruz kalan trakeal bölgenin ön görüntüleri (Ek Şekil 1), LV-MP ile tedavi edilen grubun bir mıknatıs varlığında önemli ölçüde daha yüksek transdüksiyon seviyelerine sahip olduğunu gösterdi (Şekil 9a).Kontrol grubunda sadece az miktarda mavi LacZ boyaması mevcuttu (Şekil 9b).X-Gal ile boyanmış normalleştirilmiş bölgelerin miktarının belirlenmesi, LV-MP'nin manyetik alan varlığında uygulanmasının yaklaşık 6 kat iyileşme ile sonuçlandığını gösterdi (Şekil 9c).
LV-MP (a) manyetik alan varlığında ve (b) mıknatıs yokluğunda trakeal transdüksiyonu gösteren kompozit görüntülerin örneği.(c) Bir mıknatıs kullanımıyla trakeadaki LacZ transdüksiyonunun normalleştirilmiş alanında istatistiksel olarak anlamlı iyileşme (*p = 0,029, t-testi, grup başına n = 3, ortalama ± ortalamanın standart hatası).
Nötr hızlı kırmızı lekeli bölümler (Ek Şekil 2'de gösterilen örnek), LacZ lekeli hücrelerin daha önce bildirildiği gibi aynı numunede ve aynı konumda mevcut olduğunu gösterdi.
Hava yolu gen terapisindeki temel zorluk, taşıyıcı parçacıkların ilgi alanlarında kesin lokalizasyonu ve hava akışı ve aktif mukus temizliği varlığında mobil akciğerde yüksek düzeyde transdüksiyon verimliliği elde edilmesidir.Kistik fibrozdaki solunum yolu hastalıklarının tedavisine yönelik LV taşıyıcıları için, taşıyıcı parçacıkların iletken hava yollarında kalma süresinin arttırılması şimdiye kadar ulaşılamayan bir hedef olmuştur.Castellani ve arkadaşlarının işaret ettiği gibi, transdüksiyonu geliştirmek için manyetik alanların kullanılması, elektroporasyon gibi diğer gen dağıtım yöntemlerine göre avantajlara sahiptir çünkü basitlik, ekonomi, lokalize teslimat, artan verimlilik ve daha kısa inkübasyon süresini birleştirebilir.ve muhtemelen daha düşük bir araç dozu10.Bununla birlikte, dış manyetik kuvvetlerin etkisi altında hava yollarında manyetik parçacıkların in vivo birikmesi ve davranışı hiçbir zaman tanımlanmamıştır ve aslında bu yöntemin sağlam, canlı hava yollarında gen ekspresyon seviyelerini arttırma yeteneği in vivo olarak kanıtlanmamıştır.
PCXI senkrotronu üzerindeki in vitro deneylerimiz, MP polistiren hariç test ettiğimiz tüm parçacıkların, kullandığımız görüntüleme düzeneğinde görünür olduğunu gösterdi.Bir manyetik alanın varlığında, manyetik alanlar, uzunluğu parçacıkların türüne ve manyetik alanın gücüne (yani mıknatısın yakınlığı ve hareketine) bağlı olan sicimler oluşturur.Şekil 10'da gösterildiği gibi, gözlemlediğimiz sicimler, her bir parçacık mıknatıslanıp kendi yerel manyetik alanını indükledikçe oluşur.Bu ayrı alanlar, diğer parçacıkların yerel çekim ve itme kuvvetlerinden kaynaklanan yerel kuvvetler nedeniyle, diğer benzer parçacıkların toplanmasına ve grup sicim hareketleriyle bağlanmasına neden olur.
(a, b) sıvıyla dolu kılcal damarların içinde oluşan parçacık zincirlerini ve (c, d) havayla dolu bir trakeayı gösteren diyagram.Kılcal damarların ve trakeanın ölçeğe göre çizilmediğine dikkat edin.Panel (a) ayrıca zincirler halinde düzenlenmiş Fe3O4 parçacıkları içeren MF'nin bir tanımını da içerir.
Mıknatıs kılcal damar üzerinde hareket ettiğinde parçacık dizisinin açısı, Fe3O4 içeren MP3-5 için kritik eşiğe ulaştı; bundan sonra parçacık dizisi artık orijinal konumunda kalmadı, yüzey boyunca yeni bir konuma hareket etti.mıknatıs.Bu etki muhtemelen cam kılcal yüzeyinin bu hareketin oluşmasına izin verecek kadar pürüzsüz olması nedeniyle ortaya çıkar.İlginçtir ki, MP6 (CombiMag) bu şekilde davranmadı; bunun nedeni belki de parçacıkların daha küçük olması, farklı bir kaplamaya veya yüzey yüküne sahip olması veya özel taşıyıcı sıvının hareket etme yeteneklerini etkilemesiydi.CombiMag parçacık görüntüsündeki kontrast da daha zayıf; bu da sıvı ve parçacıkların aynı yoğunluğa sahip olabileceğini ve dolayısıyla birbirlerine kolaylıkla hareket edemeyeceklerini gösteriyor.Mıknatıs çok hızlı hareket ederse parçacıklar da sıkışabilir; bu da manyetik alan kuvvetinin her zaman sıvıdaki parçacıklar arasındaki sürtünmenin üstesinden gelemeyeceğini gösterir; bu da manyetik alan kuvvetinin ve mıknatıs ile hedef alan arasındaki mesafenin aynı şekilde gelmemesi gerektiğini gösterir. sürpriz.önemli.Bu sonuçlar aynı zamanda mıknatısların hedef alandan akan birçok mikropartikülleri yakalayabildiğini, ancak CombiMag partiküllerini trakea yüzeyi boyunca hareket ettirme konusunda mıknatıslara güvenilemeyeceğini de göstermektedir.Bu nedenle, in vivo LV MF çalışmalarının, hava yolu ağacının belirli alanlarını fiziksel olarak hedeflemek için statik manyetik alanlar kullanması gerektiği sonucuna vardık.
Parçacıklar vücuda verildikten sonra, vücudun karmaşık hareketli dokusu bağlamında tanımlanmaları zordur, ancak MP dizelerini "kıpırdatmak" için mıknatısın trakea üzerinde yatay olarak hareket ettirilmesiyle algılama yetenekleri geliştirilmiştir.Gerçek zamanlı görüntüleme mümkün olsa da, hayvan insanca öldürüldükten sonra parçacık hareketini fark etmek daha kolaydır.Mıknatıs görüntüleme alanı üzerine yerleştirildiğinde MP konsantrasyonları genellikle bu konumda en yüksekti, ancak bazı parçacıklar genellikle trakeanın daha aşağılarında da bulundu.İn vitro çalışmaların aksine, parçacıklar bir mıknatısın hareketiyle trakeadan aşağı sürüklenemez.Bu bulgu, trakea yüzeyini kaplayan mukusun tipik olarak solunan parçacıkları nasıl işlediği, bunları mukus içinde nasıl yakaladığı ve daha sonra muko-siliyer temizleme mekanizması yoluyla nasıl temizlediği ile tutarlıdır.
Trakeanın üstünde ve altında mıknatısların çekim için kullanılmasının (Şekil 3b), bir noktada yüksek oranda yoğunlaşan bir manyetik alan yerine daha düzgün bir manyetik alanla sonuçlanabileceğini ve potansiyel olarak parçacıkların daha düzgün bir dağılımına yol açabileceğini varsaydık..Ancak ön çalışmamız bu hipotezi destekleyecek net bir kanıt bulamadı.Benzer şekilde, bir çift mıknatısı itecek şekilde ayarlamak (Şekil 3c), görüntü alanına daha fazla parçacık yerleşmesiyle sonuçlanmadı.Bu iki bulgu, çift mıknatıslı kurulumun MP işaretlemesinin yerel kontrolünü önemli ölçüde iyileştirmediğini ve ortaya çıkan güçlü manyetik kuvvetlerin ayarlanmasının zor olduğunu ve bu yaklaşımın daha az pratik hale geldiğini göstermektedir.Benzer şekilde, mıknatısın trakeanın üstüne ve çaprazına doğru yönlendirilmesi (Şekil 3d) de görüntülenen alanda kalan parçacıkların sayısını artırmamıştır.Bu alternatif konfigürasyonlardan bazıları, biriktirme bölgesindeki manyetik alan kuvvetinde bir azalmaya neden olacağından başarılı olmayabilir.Bu nedenle, 30 derecelik tek mıknatıs konfigürasyonu (Şekil 3a), en basit ve en etkili in vivo test yöntemi olarak kabul edilir.
LV-MP çalışması, LV vektörleri CombiMag ile birleştirildiğinde ve manyetik alan varlığında fiziksel olarak rahatsız edildikten sonra iletildiğinde, kontrollere kıyasla trakeada transdüksiyon seviyelerinin önemli ölçüde arttığını gösterdi.Senkrotron görüntüleme çalışmaları ve LacZ sonuçlarına göre, manyetik alanın LV'yi trakeada tutabildiği ve akciğerin derinliklerine anında nüfuz eden vektör parçacıklarının sayısını azaltabildiği görüldü.Bu tür hedefleme iyileştirmeleri, iletilen titreleri, hedeflenmeyen transdüksiyonu, inflamatuar ve immün yan etkileri ve gen transfer maliyetlerini azaltırken daha yüksek verimliliğe yol açabilir.Önemli olan, üreticiye göre CombiMag'in diğer viral vektörler (AAV gibi) ve nükleik asitler dahil olmak üzere diğer gen transfer yöntemleriyle kombinasyon halinde kullanılabilmesidir.