Giardia duodenum, özellikle klinik ishal belirtileri olan küçük çocuklarda sık görülen bir bağırsak enfeksiyonu olan giardiasise neden olan parazitik bir organizmadır.Daha önce hücre dışı G. duodenalis'in hücre içi oligomerizasyon benzeri reseptör 3 (NLRP3) bağlayıcı nükleotidlerin aktivasyonunu tetiklediğini ve hücre dışı kesecik (EV) salgısı yoluyla konakçı inflamatuar yanıtlarını düzenlediğini bildirmiştik.Bununla birlikte, bu süreçte yer alan patojenle ilişkili duodenokokal EV'nin (GEV) tam moleküler modelleri ve NLRP3 inflamatuarının giardiasisteki rolü henüz açıklığa kavuşturulmamıştır.
GEV'deki rekombinant ökaryotik ekspresyon plazmidleri pcDNA3.1(+)-alfa-2 ve alfa-7.3 giardinler oluşturuldu, fare primer peritoneal makrofajlarına transfekte edildi ve inflamasyon hedef molekülü kaspaz-1 ölçülerek tespit edildi.p20 ekspresyon seviyesi tarandı..G. duodenalis alfa-2 ve alfa-7.3 giardinler, orijinal olarak NLRP3 inflamatuarının (NLRP3, pro-interlökin-1 beta [IL-1β], pro-kaspaz-1 ve kaspaz-1 p20), IL salgısının ölçülmesiyle tanımlandı.1β seviyeleri, apoptotik benekli protein (ASC) oligomerizasyon seviyeleri ve NLRP3 ve ASC'nin immünofloresan lokalizasyonu.NLRP3 inflamatuarının G. duodenalis'in patojenitesindeki rolü daha sonra NLRP3 aktivasyonunun bloke edildiği (NLRP3 bloke edilmiş fareler) ve vücut ağırlığındaki, duodenal parazit yükündeki ve duodenal dokudaki patolojik değişikliklerin izlendiği fareler kullanılarak değerlendirildi.Ek olarak, hiardin alfa-2 ve alfa-7.3'ün, NLRP3 inflamatuar yoluyla in vivo IL-1β salgılanmasını indükleyip tetiklemediğini araştırdık ve bu moleküllerin farelerde G. duodenalis'in patojenitesindeki rolünü belirledik.
Alfa-2 ve alfa-7.3 giardinler, in vitro NLRP3 inflamatuarının aktivasyonunu indükler.Bu, p20 kaspaz-1'in aktivasyonuna, NLRP3, pro-IL-1β ve pro-kaspaz-1 proteinlerinin ekspresyon seviyelerinde artışa, IL-1β sekresyonunda önemli bir artışa, ASA lekelerinin oluşumuna yol açtı. sitoplazma ve ASA oligomerizasyonunun indüksiyonu.NLRP3 iltihabı Penis kaybı, farelerde G. duodenalis'in patojenitesini şiddetlendirir.NLRP3 ile bloke edilmiş farelerden gavaj yoluyla kistlerle tedavi edilen fareler, artan sayıda trofozoit ve duodenal villusta, küçülmüş ve dallanmış nekrotik kriptlerle karakterize edilen ciddi hasar sergiledi.İn vivo deneyler, giardin alfa-2 ve alfa-7.3'ün, NLRP3 inflamatuar yoluyla IL-1β salgılanmasını indükleyebildiğini ve giardin alfa-2 ve alfa-7.3 ile immünizasyonun, farelerde G. duodenalis'in patojenitesini azalttığını göstermiştir.
Birlikte ele alındığında, bu çalışmanın sonuçları, giardia alfa-2 ve alfa-7.3'ün, konakçı NLRP3 inflamasyonunun yukarı regülasyonuna neden olduğunu ve giardiasisin önlenmesi için umut verici hedefler olan farelerde G. duodenalis'in enfektivitesini azalttığını göstermektedir.
Giardia duodenum, ince bağırsakta yaşayan ve özellikle gelişmekte olan ülkelerdeki küçük çocuklar arasında yılda 280 milyon ishalli giardiasis vakasına neden olan hücre dışı bir protozoan parazittir [1].İnsanlar, daha sonra mideye giren ve mide sıvılarıyla atılan M. duodenum kistleriyle kontamine olmuş içme suyu veya yiyeceklerle enfekte olurlar.Giardia duodenum trofozoitleri duodenum epiteline bağlanarak bulantı, kusma, ishal, karın ağrısı ve kilo kaybına neden olur.İmmün yetmezliği ve kistik fibrozisi olan kişiler enfeksiyona karşı hassastır.Enfeksiyon ayrıca oral ve anal seks yoluyla da meydana gelebilir [2].Duodenal enfeksiyonlarda metronidazol, tinidazol ve nitazoksanit gibi ilaçlar tercih edilen tedavi seçenekleridir.Ancak bu kemoterapi ilaçları bulantı, karsinogenez ve genotoksisite gibi olumsuz yan etkilere neden olmaktadır (4).Bu nedenle G. duodenalis enfeksiyonunu önlemek için daha etkili stratejilerin geliştirilmesi gerekmektedir.
İnflamasomlar, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir parçası olan, patojen istilasına karşı savunmaya yardımcı olan ve inflamatuar tepkilere aracılık eden bir sitozolik protein kompleksleri sınıfıdır [5].Bu enflamasomlar arasında, nükleotit bağlayıcı oligomerizasyon (NOD) reseptör 3 (NLRP3) nükleotit bağlayıcı oligomerizasyon (NLRP3) nükleotit bağlayıcı benzeri enflamazom, çeşitli patojen/hasarla ilişkili moleküler modeller (PAMP/ DAMP), doğuştan gelen bağışıklık sistemini tanır, aktive eder.ve birçok inflamatuar hastalıkta bağırsak homeostazisini düzenler [6,7,8].Örüntü tanıma reseptörü (PRR) NLRP3, bir adaptör apoptotik benekli protein (ASC) ve bir efektör procaspase-1 veya procaspase-11'den oluşur.NLRP3 inflamatuarı, Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] ve Leishmania çalışmalarında gözlemlendiği gibi patojen istilasına karşı bir konakçı görevi görür.[11], ancak aynı zamanda NLRP3 inflamatuarının aktivasyonunun koruyucu bağışıklık tepkilerini sınırladığı ve örneğin solucanlarda hastalığın ilerlemesini şiddetlendirdiği de rapor edilmiştir [12].Önceki bulgularımıza dayanarak, hücre dışı G. duodenalis'in, NLRP3 inflamasyonunun hücre içi aktivasyonunu tetiklediğini ve hücre dışı vezikülleri (EV'ler) salgılayarak konakçının inflamatuar yanıtlarını modüle ettiğini bildirmiştik [13].Bununla birlikte, NLRP3 inflamatuarının G. duodenalis enfeksiyonunda in vivo rolü henüz belirlenmemiştir.
Giardinler başlangıçta G. duodenalis hücre iskeletinin yapısal bileşenleri olarak tanımlandı ve ince bağırsakta trofozoit hareketliliği ve epitelyal hücre bağlanmasında önemli bir rol oynadı.G. duodenalis trofozoitleri çevreye daha iyi uyum sağlamak ve patojenitelerini arttırmak için 8 flagella, 1 orta gövde ve 1 ventral diskten oluşan benzersiz bir hücre iskeleti yapısı geliştirmiştir [14].Giardia duodenumun trofozoitleri, hücre iskeletlerini üst ince bağırsağa, özellikle de duodenuma nüfuz etmek ve enterositlere bağlanmak için kullanır.Sürekli olarak göç ederler ve hücre metabolizmasını kullanarak epitel hücrelerine bağlanırlar.Bu nedenle hücre iskeleti ile virülans arasında yakın bir ilişki vardır.Giardia duodenum'a özgü giardinler hücre iskeleti yapısının bileşenleridir [15] ve dört sınıfa ayrılırlar: α-, β-, γ- ve δ-giardinler.α-giardin ailesinin 21 üyesi vardır ve bunların hepsi kalsiyuma bağlı olarak fosfolipitleri bağlama yeteneğine sahiptir [16].Ayrıca hücre iskeletini hücre zarına bağlarlar.G. duodenalis'in neden olduğu ishali olan bireylerde, α-giardinler yüksek oranda eksprese edilir ve enfeksiyon sırasında immünoreaktiftir [17].Giardia alfa-1 bazlı heterolog aşılar farelerde giardiasise karşı koruma sağlar ve aşı gelişimi için potansiyel aday antijenlerdir [18].Plazma zarı ve flagellada lokalize olan ancak ventral diskte bulunmayan alfa-8 giardin, G. duodenalis'teki trofozoitlerin hareketliliğini ve büyüme hızını arttırır [19].Alfa-14 giardin flagella üzerindeki mikrotübül yapılarına bağlanır ve G. duodenalis'in canlılığını etkiler [20].Alfa-11 giardin yaşam döngüsü boyunca bol miktarda bulunur ve alfa-11 giardinin aşırı ekspresyonu G. duodenalis'in kendisine zarar verir [21].Ancak alfa-2 giardinin ve alfa-7.3 giardinin G. duodenalis enfeksiyonuna ve altta yatan mekanizmalara karşı koruyucu olup olmadığı açık değildir.
Bu çalışmada, rekombinant ökaryotik ekspresyon plazmitleri pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin ve pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin, konakçı NLRP3'ü aktive etmek için fare primer peritoneal makrofajlarına transfekte edildi.Daha sonra iltihaplı hedefler tarandı.Ayrıca NLRP3 inflamatuarının G. duodenalis'in patojenitesindeki rolünü değerlendirdik, alfa-2 ve alfa-7,3 giardinlerin in vivo NLRP3 inflamatuarının aktivasyonunu indükleyip tetiklemediğini araştırdık ve giardinin bu iki rolünün G. duodenalis'in patojenitesinde olduğunu belirledik. G. duodenalis.Ortak amacımız G. duodenalis enfeksiyonunun önlenmesi için umut verici hedefler geliştirmekti.
5-8 haftalık yabani tip (WT) C57BL/6 dişi fareler, Liaoning Changsheng Experimental Animal Center'dan (Liaoning, Çin) satın alındı.Farelerin suya serbest erişimi vardı, sterilize edilmiş yiyecekler verildi ve 12/12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsünde tutuldular.Enfeksiyondan önce farelere, ampisilin (1 mg/mL), vankomisin (1 mg/mL) ve neomisin (1,4 mg/mL) (tümü Şangay, Çin'den satın alınmıştır, yapay organizmalar) ile desteklenmiş içme suyunda istenildiği kadar antibiyotik verilmiştir [22 ]]24 saatten fazla yeme ve içme yeteneğini kaybeden ve vücut ağırlığının ≥%20'sini kaybeden farelere, servikal dislokasyon yoluyla insani bir şekilde ötenazi uygulandı.
WB G. duodenalis trofozoitleri (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu, Manassas, ABD), %12,5 fetal sığır serumu (FBS; Every Green, Zhejiang, Çin) ve %0,1 sığır safrası (Sigma-Aldrich, St. Missouri, ABD) ile desteklendi. ).ABD) mikroaerobik koşullar altında.Birleşik trofozoitler buz üzerinde toplandı ve daha fazla üreme için 1:4 oranında pasajlandı.
Giardia duodenum kistleri daha önce tarif edildiği gibi indüklendi [23], trofozoitler logaritmik fazda toplandı ve daha sonra kapsülleme indükleyici ortam, pH 7,1 (modifiye TYI-S-33) ile 1 x 106 trofozoit/mL'lik nihai konsantrasyona kadar seyreltildi.safra konsantrasyonu %0,05 orta).Trofozoitler, logaritmik büyüme fazına kadar anaerobik koşullar altında 37°C'de kültürlendi.Ortamı kist indükleyici ortama (pH 7,8; ​​%1 safra konsantrasyonuyla değiştirilmiş TYI-S-33 ortamı) ve G. duodenalis'i 37°C'de 48-96 saat boyunca kültüre değiştirin; bu sırada oluşum kistleri mikroskop altında gözlemlendi.Trofozoitlerin çoğunun kist oluşturması teşvik edildikten sonra kültür karışımı toplandı ve kalan trofozoitlerin parçalanması için steril deiyonize su içinde yeniden süspanse edildi.Kistler sayıldı ve farelerde mide tüpü yoluyla sonraki analizler için 4°C'de saklandı.
Giardia hücre dışı kesecikleri (GEV'ler) daha önce açıklandığı gibi zenginleştirildi [13].Logaritmik büyüme fazındaki trofozoitler, eksozomu tükenmiş FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, İsrail) ile hazırlanan modifiye TYI-S-33 ortamında 1 x 106 parazit/mL nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edildi ve 12 saat boyunca inkübe edildi.2000 g'de 10 dakika, 10.000 g'de 45 dakika ve 100.000 g'de 60 dakika santrifüjleme yoluyla kültür süpernatanından izole edildi.Çökeltiler fosfat tamponlu salinde (PBS) çözündürüldü, bir BCA protein tahlil kiti (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak miktarı belirlendi ve -80°C'de saklandı veya doğrudan başka analizler için kullanıldı.
Birincil fare peritoneal makrofajları daha önce açıklandığı gibi hazırlandı [24].Kısaca, farelere (6-8 haftalık) 2,5 ml %2,98 Difco sıvı tiyoglikol ortamı (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD) (intraperitoneal olarak [ip]) enjekte edildi ve 3-4 damak ile beslendi.Ötenazi sonrasında farelerin karın boşluğundan bir makrofaj süspansiyonu toplandı ve 3 kez 1000 g'de 10 dakika boyunca santrifüj edildi.Hasat edilen hücreler, hücre saflığı >%98 olana kadar CD11b işaretçisi kullanılarak akış sitometrisi ile tespit edildi, ardından 6 kuyulu hücre kültürü plakalarına (4,5 x 106 hücre/oyuk) eklendi ve 37°C'de %10 FBS (Biyoindustry) ile inkübe edildi.ve %5 CO2.
RNA, 1 ml TRIzol reaktifi (Vazyme, Nanjing, Çin) içindeki 1 x 107 trofozoitten ekstre edildi, genomik DNA, MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Çin) kullanılarak toplam G. duodenalis RNA'sından ekstre edildi ve tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezlendi. üreticinin talimatlarına göre MonScript RTIIII Super Mix (Monad) kullanılarak.
Hedef G. duodenalis genine ilişkin CDS sekans bilgisi NCBI GenBank'tan elde edildi.Her hedef gen için spesifik kesintisiz klonlama primerleri tasarlamak amacıyla Primer 5.0'ı kullanın.İleri primer (5'-3') üç bölümden oluşur: doğrusallaştırılmış bir vektör pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) ile örtüşen bir dizi ve ATG ve GNN başlangıç ​​kodonları (ilk baz G değilse).Bu, ifadenin verimliliğini artırmak için yapılır.Ek olarak en az 16 bp kombine baz (GC içeriği %40–60/Tm yaklaşık 55 °C).Ters primer (5′-3′) iki parçadan oluşur; EcoRV doğrusallaştırılmış vektör pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) ile örtüşen bir dizi ve en az 16 bp'lik birleştirilmiş baz.(son iki durak hariç).bazlar), rekombinant plazmitlerin etiketli proteinlerini ifade etmesine izin vermek için AA veya GA gibi bir kodon).Primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir ve Kangmet Bioteknoloji Co., Ltd. (Changchun, Çin) tarafından sentezlenmiştir.
Hedefler, şablon olarak hazırlanan G. duodenalis cDNA'sı kullanılarak Pfu DNA polimeraz (Tiangen, Pekin, Çin) veya Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Pekin, Çin) kullanılarak büyütüldü.Ökaryotik ekspresyon vektör plazmidi pcDNA3.1(+), kısıtlama enzimi EcoRV ile doğrusallaştırıldı ve Fast AP (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak fosforile edildi.Doğrusallaştırılmış pcDNA3.1(+) fragmanları ve amplifiye edilmiş hedef gen fragmanları, bir DNA jel saflaştırma kiti (Tiangen) kullanılarak saflaştırıldı ve bir Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak ölçüldü.pcDNA3.1(+) fragmanı ve her hedef gen fragmanı, MonClone tekli düzenek klonlama karışımı (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Çin) kullanılarak yeniden birleştirildi ve Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Çin) kullanılarak DNA dizilimi ile doğrulandı..
Endotoksin içermeyen plazmitler pcDNA3.1(+)-alfa-2 ve pcDNA3.1(+)-alfa-7.3, SanPrep Endotoksin içermeyen Plazmit Mini Kiti (Sangon Biotech) kullanılarak üretildi.Elüsyon tamponundaki EDTA'nın transfeksiyon tahliline müdahale etmemesini sağlamak için konsantrasyon 500 ng/ul'nin üzerinde tutuldu.Birincil fare peritoneal makrofajları, 12 saat boyunca tam RPMI 1640 ortamı (Biological Industries) içeren 6 oyuklu plakalarda kültürlendi, daha sonra hücreler, penisilin ve streptomisini çıkarmak için ılık PBS içerisinde 3 kez yıkandı ve daha sonra tam ortam ile desteklenmiş ortamda yıkandı.Endotoksin içermeyen plazmidler pcDNA3.1(+)-alfa-2 ve pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2.5 ug), 125 ul Opti-MEM azaltılmış serum ortamında (Gibco, Thermo Fisher Scientific) seyreltildi..Daha sonra 5 ul Lipofectamine 2000 transfeksiyon reaktifi (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), 125 ul düşük serumlu Opti-MEM ortamında seyreltildi.Seyreltilmiş endotoksin içermeyen plazmidi Lipofectamine 2000 ile karıştırarak ve karışımın oda sıcaklığında 5 dakika beklemesine izin vererek lipozom-DNA kompleksleri hazırlayın.Kompleksleri her kuyucuktaki hücrelere ayrı ayrı aktarın ve yavaşça karıştırın.4 saat sonra hücre kültürü ortamı, 2 ml tam RPMI 1640 ortamı ile değiştirildi ve kültür, 24 saat süreyle sürdürüldü.Taze hücre kültürü ortamı hücrelere ilave edildi ve tahlil tasarımına bağlı olarak çeşitli zaman noktalarında inkübe edildi.
Süpernatanlardan ve hücre lizatlarından protein örnekleri daha önce anlatıldığı gibi hazırlandı [25].Pro-IL-1β, pro-kaspaz-1, kaspaz-1 p20, NLRP3, β-aktin ve His-etiketi için membran transfer parametreleri 200 mA/90 dakika idi.İnterlökin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, ABD), kaspaz-1 (p20) (Adipogen, İsviçre) ve NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, İsviçre) ve His etiketini hedefleyen 1:5000 için ( Amylet Scientific, Wuhan, Çin) ve β-aktin (Proteintech, Wuhan, Çin).
Disüksinimid suberat (DSS) ile çapraz bağlanma daha önce anlatıldığı gibi gerçekleştirildi [26].Hücreler 3 kez soğuk PBS ile yıkandı ve 25 mM Na2P04, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES ve 125 mM NaHC03 içeren 50 ul ASC reaksiyon tamponunda (pH 8.0) 27 gauge iğne ile tamamen parçalandı.Karışım 5000 g'de 3 dakika boyunca santrifüjlendi ve pelet, 10 ul DSS (DMSO içerisinde 25 mM) ve 40 ul ASC reaksiyon tamponu ile 37°C'de 30 dakika boyunca dikildi.5000 g'de 10 dakika santrifüj edildikten sonra pelet, 40 ul ASC reaksiyon tamponu ve 10 ul 6x protein yükleme tamponu (TransGen, Pekin, Çin) içeren bir çözelti içerisinde çözüldü ve ardından çözelti, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle söndürüldü. dk., Daha sonra 10 dakika kaynatın.Protein numuneleri daha sonra 1:500 seyreltme oranında birincil anti-ASC antikorları (Wanleibio, Shenyang, Çin) kullanılarak Western blot işlemine tabi tutuldu.
Daha önce tarif edilen bir prosedürün [13] ardından, hücre kültürü süpernatanları toplandı ve proinflamatuar sitokin IL-1β'nın salgılanması, fare IL-1 Beta ELISA kiti (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) kullanılarak belirlendi.IL-1β standart eğrisini kullanarak OD450nm değerlerini protein konsantrasyonlarına dönüştürün.
Lamel üzerine kaplanan hücreler, ılık PBS'de 3 kez nazikçe yıkandı, oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca doku hücre fiksatifinde (Biosharp, Pekin, Çin) sabitlendi, 100°C'de %0.1 Triton X-Permeabilize'de (PBS'de seyreltilmiş; Biosharp) ) oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bloke edin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca %5 sığır serum albümini (PBS içinde) içinde bloke edin.Hücreler daha sonra gece boyunca 4°C'de sırasıyla ASC (1:100 seyreltme) veya NLRP3'e (1:100 seyreltme) karşı birincil antikorlar ve Cy3 etiketli keçi anti-tavşan IgG(H+L) (1:400; EarthOx) ile inkübe edildi. , San Francisco, CA, ABD) veya FITC-konjuge keçi anti-fare IgG'si (1:400; Earthox) ile 37°C'de karanlıkta 1 saat boyunca gece boyunca uygulandı.Çekirdekler, 5 dakika boyunca Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Çin) ile boyandı ve bir floresan mikroskobu (Olympus Corporation, Tokyo, Japonya) altında gözlemlendi.
Fareler dört gruba ayrıldı (her grupta n = 7): (i) PBS ile tedavi edilen negatif kontrol grubu (yalnızca PBS; sondayla 100 ul/fare PBS, ardından 3 saat sonra günlük intraperitoneal enjeksiyon 100 ul/fare PBS).7 gün boyunca sürekli olarak);(ii) MCC950 inhibitörü [27] ile tedavi edilen negatif kontrol grubu (PBS sonda yoluyla 100 ul/fare, 3 saat sonra, 10 mg/kg vücut ağırlığı [BW] MCC950 [PBS içinde] her gün intraperitoneal olarak uygulandı, 7 gün süreyle);(iii) G. duodenalis kisti enfeksiyonu grubu (sondayla 1.5 x 106 kist/fare, 3 saat sonra, 7 gün boyunca günlük olarak intraperitoneal olarak uygulanan 100 ul/fare PBS);(iv) G. duodenalis kisti kombine enfeksiyon grubu MCC950 inhibitör tedavi grubu (sondayla 1.5x106 kist/fare, 7 gün boyunca 3 saatte intraperitoneal olarak günde 10 mg/kg vücut ağırlığı MCC950).Her farenin vücut ağırlığı günlük olarak izlendi ve tüm farelere 7. günde ötenazi uygulandı.Hasat edilen duodenum (3 cm uzunluğunda), 1 ml PBS içerisinde küçük parçalar halinde kesildi, kistler, 4°C'de PBS içerisinde gece boyunca yok edildi ve G. duodenalis trofozoitleri.Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama için taze duodenum (1 cm uzunluğunda) izole edildi.
Fareler iki gruba ayrıldı: (i) MOCK kontrol grubu ve (ii) MCC950 inhibitör grubu.Her grupta beş tedavi vardı (n = 7/tedavi grubu): (i) PBS tedavisi negatif kontrol grubu (yalnızca PBS; 100 µl/fare PBS, kas içi (IM) enjeksiyon (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plazmid negatif kontrol grubu (100 µg/fare DNA, kas içi enjeksiyon yoluyla); (iii) G. duodenalis kist enfeksiyonu pozitif kontrol grubu (1,5 x 106 kist/fare, sondayla) (iv) a pcDNA3.1(+)-alfa-2 plazmidi (100 µg/fare DNA, kas içi enjeksiyonla) ile tedavi edilen grup ve (v) pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 plazmidi (100 µg/fare) ile tedavi edilen bir grup DNA, 12 saatlik geçişin ardından, MCC950 inhibitör grubundaki farelere 7 gün boyunca günlük intraperitoneal MCC950 enjeksiyonu (10 mg/kg vücut ağırlığı) yapılırken, MOCK grubundaki farelere eşit hacimde PBS tedavisi uygulandı. Kan örnekleri Gözbebekleri olan farelerden toplandı ve gece boyunca 4 °C'de bırakıldı. Serum numuneleri, enzim bağlantılı immünosorbent tahlili (ELISA) ve IL-1β seviyelerinin ölçümleri kullanılarak izole edildi.
Otuz beş fare beş gruba ayrıldı (n=7/grup).Grup 1, PBS ile tedavi edilen bir negatif kontrol grubuydu: farelere kas içinden ve 3 gün sonra sondayla 100 ul PBS verildi.Grup 2, G. duodenalis kistleri ile enfekte edilmiş bir pozitif kontrol grubudur: farelere 100 ul PBS enjekte edildi ve 3 gün sonra 1.5 x 106 kist/fare intragastrik olarak enjekte edildi.Üçüncü grup – duodenal kist enfeksiyonu için bir kontrol grubuyla kombinasyon halinde pcDNA3.1(+) ile plazmid immünizasyonu: farelere ağızdan 100 µg plazmit DNA pcDNA3.1(+)(im) verildi, birkaçı için 1.5x106 kist/fare 3 günler.Grup 4 ve 5, G. duodenalis kist enfeksiyonu ile kombinasyon halinde rekombinant pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin plazmidi veya pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin plazmidiydi.Deney grubu: farelere 100 µg pcDNA3 verildi.1(+)-giardin plazmit DNA'sı (im), ardından 3 gün sonra 1.5 x 106 kist/fareye sondayla enjekte edildi.Her farenin vücut ağırlığı, G. duodenalis kistinin tüp yoluyla yerleştirilmesinden sonra izlendi.Parazit yükü ölçümleri ve HE boyama analizi için taze duodenum toplandı.
Histopatolojik değişiklikler daha önce yayınlanmış bir prosedüre göre analiz edildi [30].Taze duodenum doku hücresi sabitleyici ile sabitlendi, parafine gömüldü, 4 mikronluk kesitler halinde kesildi, H&E ile boyandı ve ışık mikroskobu altında analiz edildi.Yedi bağımsız fareden alınan yedi doku kesitindeki temsili patolojik değişiklikler, tedaviden habersiz bir patolog tarafından değerlendirildi ve 200x büyütmede yakalandı.Villusun uzunluğu ve kriptaların derinliği daha önce açıklanan yöntemlere uygun olarak ölçüldü.
İn vitro ve in vivo sonuçlar üç kopya halinde elde edildi.Grafikler GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ABD) kullanılarak oluşturuldu.İki grup arasındaki farklar t-testi ile analiz edilirken, ≥3 grup arasındaki farklar SPSS yazılımı (versiyon 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, ABD) kullanılarak tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile analiz edildi.Veriler, Levene testi ve ardından Bonferroni'nin post hoc testi (B) kullanılarak varyansın homojenliği açısından analiz edildi.Anlamlılık P<0,05, P<0,01 ve P<0,001 (anlamlı değil [ns]) (P>0,05) olarak ifade edilir.
Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi'ndeki (KEGG) GEV proteomiklerine ilişkin önceki analizimiz, birçok hedefin inflamatuar sinyal yollarının aktivasyonuna dahil olabileceğini gösterdi [13].Gelecek vaat eden iki hedef seçtik: alfa-2 ve alfa-7.3 giardinler, bu molekülleri güçlendirdik ve bunları pcDNA3.1(+) ökaryotik ekspresyon vektörünü oluşturmak için kullandık.Sekanslamanın ardından, rekombinant pcDNA3.1(+)-alfa-2 ve alfa-7.3 giardin ekspresyon plazmitleri, birincil fare peritoneal makrofajlarına transfekte edildi ve inflamasyonun kaspaz-1 p20 imza proteini (aktive edilmiş kaspaz-1'in bir fragmanı) tanımlandı. inflamasyonu tetikleyebilecek anahtar molekülleri aydınlatıyor.Sonuçlar, alfa-2 ve alfa-7.3 giardinlerin, GEV'e benzer şekilde p20 kaspaz-1 ekspresyonunu indükleyebildiğini gösterdi.Tedavi edilmemiş negatif kontrolde (yalnızca PBS) ve plazmid kontrol pcDNA3.1(+)'da kaspaz-1 aktivasyonu üzerinde herhangi bir etki bulunmadı (Şekil 1).
P20 kaspaz-1 aktivasyonunun pcDNA3.1(+)-alfa-2 ve alfa-7.3 giardinler ile ölçümü.Rekombinant ökaryotik ekspresyon plazmidleri pcDNA3.1(+)-alfa-2 ve alfa-7.3 giardinler (her şeridin üstünde), birincil fare peritoneal makrofajlarına transfekte edildi ve kültür süpernatanları, 24 saat sonra toplandı.İmza kaspaz-1 p20 inflamatuar proteininin ekspresyon seviyelerini ölçmek için Western blot kullanıldı.Yalnızca PBS tedavi grubu (şerit C) ve pcDNA3.1(+) monoterapi grubu (pcDNA3.1 şerit) negatif kontrol olarak kullanıldı ve GEV tedavi grubu pozitif kontrol olarak kullanıldı.Rekombinant proteinin ekspresyonu, her proteinde bir histidin etiketinin saptanmasıyla doğrulandı ve beklenen protein bantları, alfa-2 giardin (38.2 kDa) ve alfa-7.3 giardin (37.2 kDa) idi.GEV, Giardia duodenum hücre dışı kesecikler, pcDNA3.1(+), EcoRV-doğrusallaştırılmış vektör, SUP, süpernatan
Alfa-2 giardinin ve alfa-7.3 giardinin, p20 kaspaz-1 ekspresyonunu indükleyip indüklemediğini ve konakçı NLRP3 inflamatuar yanıtını aktive etmede rol oynayıp oynamadığını belirlemek için pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin ve pcDNA3.1(+)-alfa -7.3 giardin, rekombinant plazmid DNA ile birincil fare peritoneal makrofajlarına transfekte edildi ve anahtar inflamatuar proteinler NLRP3'ün ekspresyon, lokalizasyon ve oligomerizasyon seviyeleri belirlendi.Bu deneyde GEV, pozitif kontrol grubu olarak kullanıldı ve tedavi uygulanmayan grup (yalnızca PBS) veya pcDNA3.1(+) transfeksiyon tedavi grubu, negatif gruptu.Sonuçlar, GEV grubunda olduğu gibi, giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 ve giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3'ün rekombinant plazmit DNA'sının, NLRP3, pro-IL-1β ve giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3'ün yukarı regülasyonuyla sonuçlandığını gösterdi. procaspase-1 ve kaspaz-1 aktivasyonu (Şekil 2a).Ek olarak, her iki giardin de önemli IL-1β salgılanmasını indüklemiştir (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007) ).;alfa-7.3 giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Şekil 2b).ASC proteinlerinin çoğu, pcDNA3.1(+)-alfa-2 veya pcDNA3.1(+)-alfa-2 veya pcDNA3.1(+)-alfa-2'nin aksine, tedavi uygulanmayan grupta veya pcDNA3.1(+) plazmidi ile transfekte edilmiş tedavi grubunda monomerikti. 7.3 giardin.ASC oligomerizasyonu, GEV pozitif kontrol grubunun veya grubunun rekombinant plazmid DNA'sında meydana geldi ve oligomerik bir form gösterdi (Şekil 2c).Bu ön veriler, alfa-2 giardinin ve alfa-7,3 giardinin, NLRP3 inflamasyon aktivasyonunu indükleyebileceğini göstermektedir.ASC ve NLRP3'ün lokalizasyonuna ilişkin müteakip immünofloresan çalışmaları, negatif kontrol grubunda ASC proteininin sitoplazma boyunca dağıldığını ve pcDNA3.1(+)-alfa-2'nin giardin veya pcDNA3 ile uyarılması üzerine bir nokta sinyali olarak göründüğünü gösterdi.1(+)-alfa-7,3 giardin grubu veya GEV pozitif kontrol grubu (Şekil 2d).Negatif kontrol ve plazmid ile tedavi edilen pcDNA 3.1 gruplarında, NLRP3 protein sinyali tespit edilmedi; pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine veya pcDNA3.1(+)-alfa-7.3'e yanıt olarak bir floresan sinyal noktası tespit edildi. belirlendi..giardin sitoplazmada veya HEV'nin uyarılması üzerine bulunur (Şekil 2e).Bu veriler ayrıca G. duodenalis giardin alfa-2 ve giardin alfa-7.3'ün fare primer peritoneal makrofajlarında NLRP3 inflamatuarını aktive ettiğini göstermektedir.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin ve pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin, fare peritoneal makrofajlarında NLRP3 inflamatuarını aktive eder.Rekombinant ökaryotik ekspresyon plazmitlerini pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin ve pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin'i birincil fare peritoneal makrofajlarına ve hücrelerine transfekte edin veya ekspresyon, oligomerizasyon analizi için süpernatantı 24 saat içinde hasat edin , salgı.ve temel inflamatuar proteinlerin lokalizasyonu.Yalnızca PBS (C) grubu ve pcDNA3.1(+) tekli tedavi grubu, negatif kontrol olarak kullanıldı ve GEV tedavi grubu, pozitif grup olarak kullanıldı.NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspaz-1 ve p20 kaspaz-1 dahil olmak üzere anahtar inflamatuar proteinler NLRP3, Western blotlama ile tespit edildi.b Süpernatanlardaki IL-1β salgılama seviyeleri, enzim bağlantılı immünosorbent tahlili (ELISA) kullanılarak belirlendi.Kontrol ve deney grupları arasındaki farklar, SPSS yazılımının 22.0 sürümü kullanılarak tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile analiz edildi.Yıldız işaretleri, **P<0,01 ve ***P<0,001 grupları arasındaki önemli farklılıkları gösterir.c Peletlerdeki ASC oligomerizasyon seviyeleri DSS çapraz bağlama analizi ile belirlenirken hücre lizatlarındaki ASC seviyeleri bir yükleme kontrolü olarak kullanıldı.d İmmünofloresan kullanılarak ISC lokalizasyonunun görselleştirilmesi.e NLRP3'ün lokalizasyonunu görselleştirmek için immünofloresan kullanıldı.ASC, apoptotik benek benzeri protein;IL, interlökin;NLRP3, nükleotit bağlayıcı oligomerizasyon benzeri reseptör 3;ns, anlamlı değil (P > 0,05)
Hem G. duodenalis hem de salgıladığı GEV'ler, NLRP3 inflamatuarını aktive eder ve in vitro konakçı inflamatuar yanıtlarını düzenler.Bu nedenle, NLRP3 inflamatuarının G. duodenalis'in patojenitesindeki rolü belirsizliğini koruyor.Bu sorunu araştırmak için G. duodenalis kisti ile enfekte olmuş fareler ile G. duodenalis kisti + MCC950 inhibitör tedavisi ile enfekte olmuş fareler arasında bir deney tasarladık ve G. duodenalis kisti ile enfekte edildiğinde NLRP3 inflamatuar ekspresyonunu karşılaştırdık.Deneyin ayrıntılı şeması Şekil 3a'da gösterilmektedir.Farklı tedavi gruplarındaki farelerin vücut ağırlığındaki değişiklikler, kist enfeksiyonundan sonra 7 gün boyunca izlendi ve sonuçlar, Şekil 3b'de gösterildi.Saf PBS ile tedavi edilen grupla karşılaştırıldığında sonuçlar şunu gösterdi: (i) G. duodenalis kisti ile enfekte olmuş farelerin vücut ağırlığı enfeksiyondan sonraki 3. günden 7. güne azaldı;(ii) MCC950 inhibitörüyle tedavinin farelerin vücut ağırlığı üzerinde önemli bir etkisi olmadı..Tek enfeksiyon grubuyla karşılaştırıldığında, MCC950 ile tedavi edilen duodenal enfeksiyon grubunun BW'si değişen derecelerde azaldı (1. Gün: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2. Gün: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; 3. Gün: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; 4. Gün: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; (3, 24)=0,6497, P=0,0645; 6. Gün: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; 7. Gün: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Bu veriler, NLRP3 inflamatuarının fareleri duodenal enfeksiyonun erken aşamalarında (2-4 gün) önemli kilo kaybından koruduğunu göstermektedir.Daha sonra duodenal lavaj sıvısında G. duodenalis trofozoitlerini tespit etmeyi amaçladık ve sonuçlar Şekil 3c'de gösterilmektedir.G. duodenalis kist enfeksiyonu grubuyla karşılaştırıldığında duodenumdaki trofozoitlerin sayısı, NLRP3 inflamatuarının bloke edilmesinden sonra önemli ölçüde arttı (t(12) = 2,902, P = 0,0133).HE ile boyanan duodenal dokular, yalnızca PBS ve MCC950 ile tedavi edilen negatif kontrolle karşılaştırıldığında şunları gösterdi: (i) G. duodenalis kist enfeksiyonu duodenal villusta hasara yol açtı (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488) ) ve kript atrofisi (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) G. duodenalis kistleri ile enfekte edilmiş ve MCC950 inhibitörleri ile tedavi edilmiş farelerden alınan duodenum.duodenal villus hasar görmüş ve ölmüştür (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144), atrofi ve kript dallanmasıyla (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Şekil 3d- F) .Bu sonuçlar, NLRP3 inflamatuarının G. duodenalis'in patojenitesini azaltmada rol oynadığını göstermektedir.
Giardia duodenum enfeksiyonunda NLRP3 inflamatuarının rolü.Farelere duodenokokal kistlerle beslenme (iv) uygulandı ve daha sonra MCC950 (ip) ile veya MCC950 olmadan tedavi edildi.Kontrol olarak PBS veya MCC950'li tek tedavi grupları kullanıldı.Deney grubu ve tedavi rejimi.b Çeşitli tedavi gruplarının her birindeki farelerin vücut ağırlığı 7 gün boyunca izlendi.G. duodenalis enfeksiyonu grubu ile G. duodenalis + MCC950 enfeksiyonu tedavi grubu arasındaki fark, SPSS yazılımının 22.0 sürümü kullanılarak t-testi ile analiz edildi.Yıldız işaretleri *P<0,05, **P<0,01 veya ***P<0,001'de önemli farklılıkları gösterir.c Parazit yükü duodenal lavaj sıvısındaki trofozoitlerin sayısı sayılarak belirlendi.G. duodenalis enfeksiyonu grubu ile G. duodenalis + MCC950 enfeksiyonu tedavi grubu arasındaki fark, SPSS yazılımının 22.0 sürümü kullanılarak t-testi ile analiz edildi.Yıldız işaretleri *P <0,05'te önemli farklılıkları gösterir.d Duodenal histopatolojinin hematoksilen ve eozin (H&E) boyama sonuçları.Kırmızı oklar villuslardaki hasarı, yeşil oklar ise kriptalardaki hasarı gösterir.Ölçek çubuğu: 100 µm.e, f Duodenal villus yüksekliğinin ve fare kripta yüksekliğinin istatistiksel analizi.Yıldız işaretleri *P<0,05 ve **P<0,01'de önemli farklılıkları gösterir.Sonuçlar 7 bağımsız biyolojik deneyden alınmıştır.BW, vücut ağırlığı;ig, intragastrik dağıtım yolu;ip, intraperitoneal dağıtım yolu;ns, anlamlı değil (P > 0,05);PBS, fosfat tamponlu salin;WT, vahşi tip
IL-1β'nın salgılanması inflamasyon aktivasyonunun bir işaretidir.G. duodenalis alfa-2 giardin ve alfa-7.3 giardinin, NLRP3 konakçı inflamatuarını in vivo olarak aktive edip etmediğini belirlemek için, tedavi edilmemiş WT fareleri (sahte grup) ve NLRP3 inflamatuar bloke edilmiş fareleri (MCC950, tedavi grubunu inhibe etti) kullandık.Deneyin ayrıntılı şeması Şekil 4a'da gösterilmektedir.Deney grupları, PBS ile tedavi edilen farelerden, sondayla G. duodenalis kistinin tedavi edilmesinden, intramüsküler pcDNA3.1 enjeksiyonundan ve intramüsküler pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin veya pcDNA3.1-alfa-7.3 giardinin enjeksiyonundan oluşuyordu.Rekombinant plazmidin intramüsküler uygulanmasından sonraki 7. günde serum toplandı ve her gruptaki IL-1β düzeyi belirlendi.Şekil 4b'de gösterildiği gibi, MOCK grubunda: (i) PBS grubuyla karşılaştırıldığında pcDNA3.1 tedavisinin IL-1β salgılanması üzerinde anlamlı bir etkisi olmadı (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), ancak, IL-β salgılanması G. duodenalis kist grubunda önemli ölçüde yükselmişti (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardin ve pcDNA3.1- Alfa-7.3 giardinin intramüsküler enjeksiyonu, serum IL-1β seviyelerini önemli ölçüde arttırdı (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin, pcDNA3.1-alfa-2 giardin intramüsküler enjeksiyon grubunda yüksek seviyelerde IL -1β salgılanmasına neden oldu (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .MCC950 tedavi grubundaki ve MOCK grubundaki her bir grupla karşılaştırıldığında: (i) PBS kontrol grubunda ve pcDNA3.1 kontrol grubundaki IL-1β salgılama seviyeleri, MCC950 inhibitörünün bloke edilmesinden sonra belirli bir dereceye kadar azaldı, ancak fark değildi anlamlı (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) MCC950'yi bloke ettikten sonra.IL-1β salgılanması, G. duodenalis kistiyle enfekte olmuş grupta, pcDNA3.1-alfa-2 giardin grubunda ve pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin grubunda (G. duodenalis: ANOVA, F(9) önemli ölçüde azaldı. , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin: ANOVA, F(9, 58) ) = 3,540, P = 0,0164).Bu sonuçlar, alfa-2 giardinin ve alfa-7.3 giardinin in vivo NLRP3 inflamatuarının aktivasyonuna aracılık ettiğini göstermektedir.
pcDNA3.1(+)-giardinler, NLRP3 konakçı inflamatuarını in vivo olarak aktive eder.Fareler, rekombinant ökaryotik ekspresyon plazmidi pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin veya pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin ile immünize edildi (IM) ve daha sonra MCC950 (ip; MCC950 grubu) ile tedavi edildi veya edilmedi (kukla grup) ).PBS veya pcDNA3.1(+) plazmit tedavi grubu negatif kontrol olarak, G. duodenalis kisti tedavi grubu ise pozitif kontrol olarak kullanıldı.Deney grubu ve tedavi rejimi.b Farelerde IL-1β'nın serum seviyeleri 7. günde ELISA tahlili ile ölçüldü.MOCK grubundaki gruplar arasındaki farklar tek yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi ve MOCK grubu ile MCC950 grubu arasındaki farklar SPSS yazılımının 22.0 versiyonu t-testi kullanılarak analiz edildi.Yıldız işaretleri, MOCK grubundaki tedavi grupları arasındaki önemli farklılıkları gösterir; *P<0.05 ve ***P<0.001;dolar işaretleri ($), MOCK grubundaki her grup ile MCC950 grubu arasında P<0.05'te anlamlı farkları gösterir.Yedi bağımsız biyolojik deneyin sonuçları.i, kas içi enjeksiyon, ns, anlamlı değil (P > 0,05)
NLRP3 konakçı inflamatuarının alfa-2 ve alfa-7.3 giardin aracılı aktivasyonunun G. duodenalis enfeksiyonu üzerindeki etkisini araştırmak için WT C57BL/6 fareleri kullandık ve alfa-2 giardin ve alfa-7.3 giardin enjekte ettik.plazmid, 3 gün sonra G. duodenalis kistinin mide tüpü yoluyla kas içine enjekte edildi ve ardından fareler 7 gün boyunca gözlemlendi.Deneyin ayrıntılı şeması Şekil 5a'da gösterilmektedir.Her farenin vücut ağırlığı her gün ölçüldü, mide tüpünden uygulamadan sonraki 7. günde taze duodenal doku örnekleri toplandı, trofozoit sayısı ölçüldü ve histopatolojik değişiklikler gözlendi.Şekil 5b'de gösterildiği gibi, artan beslenme süresiyle birlikte her gruptaki farelerin BW'si giderek arttı.Farelerin MT'si, G. duodenalis kistlerinin intragastrik uygulanmasından sonraki 3. günde düşmeye başladı ve daha sonra giderek arttı.Alfa-2 giardin ve alfa7.3 giardinin intramüsküler enjeksiyonu ile indüklenen NLRP3 inflamatuarının aktivasyonu, farelerde kilo kaybını önemli ölçüde hafifletti (1. Gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P) = 0 ,9754 1. Gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 2. Gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; 2. Gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; 3. Gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 3. Gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083; 4. Gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, 4. Gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, 5. Gün: pcDNA3.1-alfa - 2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 5. Gün: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 6. Gün: pcDNA3 .1 - alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, 6. Gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;7. Gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 7. Gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Parazit yükü duodenumda değerlendirildi (Şekil 5c).Tedavi edilmemiş pozitif kontrol ve boş pcDNA3.1 vektörü enjekte edilen grupla karşılaştırıldığında, G. duodenalis trofozoitlerinin sayısı, a-2 giardine ve a-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha) enjekte edilen gruplarda önemli ölçüde azaldı. -2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Ayrıca giardin alfa-7.3, farelerde giardin alfa-2'ye göre daha koruyucuydu (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).HE boyamanın sonuçları şekil 2'de gösterilmektedir.5d–f.Alfa-2 giardin ve alfa-7.3 giardin enjekte edilen farelerde, G. duodenalis enjekte edilen farelere ve boş bir pcDNA3 vektörü ile kombinasyon halinde G. duodenalis enjekte edilen farelere kıyasla villus hasarı ile kendini gösteren daha az duodenal doku lezyonu vardı.1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 veya P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 veya P = 0,0055) ve azaltılmış kripto atrofisi (pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 veya P = 0,0158; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 veya P = 0,0191).Bu sonuçlar, alfa-2 giardinin ve alfa-7,3 giardinin, in vivo NLRP3 inflamatuarını aktive ederek G. duodenalis'in enfektivitesini azalttığını göstermektedir.
G. duodenalis enfeksiyonunda pcDNA3.1(+)-giardinlerin rolü.Fareler, rekombinant ökaryotik ekspresyon plazmitleri pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin veya pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin ile immünize edildi (IM) ve ardından G. duodenalis kistleri (ig) ile tehdit edildi.PBS grubu ve pcDNA3.1(+) + duodenal kist tedavi grubu negatif kontrol grubu olarak, duodenal kist tedavi grubu ise pozitif kontrol grubu olarak kullanıldı.Deney grubu ve tedavi rejimi.b Çeşitli tedavi gruplarının her birindeki farelerin MT'si, tehdit sonrası 7 gün boyunca izlendi.Yıldız işaretleri, G. duodenalis grubu ile pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin grubu arasındaki önemli farklılıkları gösterir; *P < 0,05, **P < 0,01 ve ***P < 0,001;dolar işareti ($), G. duodenalis'in her grubu ile pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 jardine grubu arasında önemli bir farkı belirtir; $$P<0.01 ve $$$P<0.001.c Parazit yükü, duodenumdan (3 cm uzunluğunda) alınan 1 ml duodenal lavajdaki trofozoitlerin sayısı sayılarak belirlendi ve duodenumun cm'si başına parazit sayısı olarak ifade edildi.G. duodenalis enfeksiyon grubu, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin grubu ve pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin grubu arasındaki farklar, SPSS yazılımı sürüm 22.0 kullanılarak tek yönlü ANOVA ile analiz edildi.Yıldız işaretleri **P<0,01 ve ***P<0,001'de önemli farklılıkları gösterir.d Duodenumdaki histopatolojik değişiklikler.Kırmızı oklar villuslardaki hasarı, yeşil oklar ise kriptalardaki hasarı gösterir.Ölçek çubuğu: 100 µm.e, f Fare duodenal villus yüksekliğinin (e) ve kript yüksekliğinin (f) istatistiksel analizi.Şekil 1d'deki gruplar arasındaki farklar, SPSS yazılımının 22.0 sürümü kullanılarak tek yönlü ANOVA ile analiz edildi.Yıldız işaretleri *P<0,05 ve **P<0,01'de önemli farklılıkları gösterir.Yedi bağımsız biyolojik deneyin sonuçları.ns, anlamlı değil (P > 0,05)
Giardia duodenum, insanlarda ve diğer memelilerde giardiasise neden olan iyi bilinen bir bağırsak parazitidir.2004 yılında, özellikle sosyoekonomik düzeyi düşük toplumlarda 6 yıllık yüksek prevalansı nedeniyle DSÖ İhmal Edilen Hastalıklar Girişimi'ne dahil edilmiştir.Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, G. duodenalis enfeksiyonuna karşı bağışıklık tepkisinde kritik bir rol oynar.Fare makrofajlarının, hücre dışı tuzakları serbest bırakarak G. duodenalis'i yutup öldürdüğü rapor edilmiştir [33].Önceki çalışmalarımız, invaziv olmayan bir hücre dışı parazit olan G. duodenalis'in, konakçı inflamatuar yanıtlarını düzenlemek için fare makrofajlarındaki p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 ve NLRP3 inflamatuar sinyal yollarını aktive ettiğini ve salınan GEV'in bu süreci geliştirebileceğini göstermiştir.13], 24].Bununla birlikte, GEV'de NLRP3 inflamatuar tarafından düzenlenen inflamasyonda yer alan kesin PAMP'ler ve NLRP3 inflamatuarının giardiasisteki rolü henüz açıklığa kavuşturulmamıştır.Bu iki soruya ışık tutmak amacıyla bu çalışmayı gerçekleştirdik.
NLRP3 inflamatuarı, bağışıklık hücrelerinin sitoplazmasında bulunur ve ürik asit kristalleri, toksinler, bakteriler, virüsler ve parazitler gibi çeşitli parçacıklar tarafından aktive edilebilir.Bakteriyel çalışmalarda toksinlerin, inflamatuar sensörleri aktive eden, inflamasyona ve hücre ölümüne yol açan anahtar PAMP'ler olduğu belirlenmiştir [34].Staphylococcus aureus'tan [35] ve Escherichia coli'den [36] hemolizin, enterotoksinden (NHE) [37] hemolisin BL (HBL) gibi bazı yapısal olarak çeşitli toksinler, NLRP3 inflamasyonunun aktivasyonunu indükler.Viral çalışmalar, SARS-COV-2 zarf (E) proteini [38] ve Zika virüsü NS5 proteini [39] gibi virülans proteinlerinin, NLRP3 reseptörü tarafından tanınan önemli PAMP'ler olduğunu göstermiştir.Parazit çalışmalarında, Toxoplasma gondii, Trichomonas vajinalis [40], Trypanosoma cruzi [41] ve Leishmania [42] gibi birçok parazitin konakçı inflamatuar aktivasyonu ile ilişkili olduğu rapor edilmiştir.Toxoplasma gondii'nin virülansı ile ilişkili yoğun granül proteinleri GRA35, GRA42 ve GRA43, Lewis sıçan makrofajlarında piroptozun indüksiyonu için gereklidir [43].Ek olarak, bazı Layşmanya çalışmaları parazit membran lipofosfoglikan [44] veya çinko metaloproteaz [45] gibi NLRP3 inflamatuarında yer alan bireysel moleküllere odaklanmıştır.Anneksin benzeri alfa-giardin gen ailesi arasında alfa-1 giardinin, bir fare modelinde G. duodenalis'e karşı koruma sağlayan potansiyel bir aşı adayı olduğu gösterilmiştir [18].Çalışmamızda Giardia'ya özgü olan ancak nispeten daha az bildirilen G. duodenalis virülans faktörleri alfa-2 ve alfa-7,3 giardinleri seçtik.Bu iki hedef gen, inflamasyon aktivasyonunun analizi için pcDNA3.1(+) ökaryotik ekspresyon sistemi vektörüne klonlandı.
Fare modelimizde bölünmüş kaspaz parçaları, inflamatuar aktivasyonun belirteçleri olarak görev yapar.Stimülasyon üzerine NLRP3, ASC ile etkileşime girer, procaspazları toplar ve pro-IL-1β ve pro-IL-18'i sırasıyla olgun IL-1β ve IL-18'e (sırasıyla -18) bölen aktif kaspazlar üretir.Enflamatuar kaspazlar (kaspazlar-1, -4, -5 ve -11), doğuştan savunma için kritik olan ve iltihaplanma ve programlanmış hücre ölümünde rol oynayan, korunmuş bir sistein proteaz ailesidir [46].Kaspaz-1 kanonik inflamatuarlar tarafından aktive edilir [47], kaspazlar-4, -5 ve -11 ise atipik inflamatuarların oluşumu sırasında bölünür [48].Bu çalışmada, fare peritoneal makrofajlarını model olarak kullandık ve G. duodenalis enfeksiyonu çalışmalarında konakçı NLRP3 inflamasyon aktivasyonunun bir belirteci olarak p20 kaspaz-1 bölünmüş kaspaz-1'i araştırdık.Sonuçlar, birçok alfa-giardinin tipik inflamasyon aktivasyonundan sorumlu olduğunu gösterdi; bu, bakteri ve virüslerde yer alan temel virülans moleküllerinin keşfiyle tutarlıdır.Bununla birlikte, çalışmamız yalnızca bir ön taramadır ve önceki çalışmamızda G. duodenalis enfeksiyonunda hem klasik hem de klasik olmayan iltihapları bulduğumuzdan, klasik olmayan iltihapları aktive edebilen başka moleküller de vardır [13].Üretilen p20 kaspaz-1'in NLRP3 inflamatuarı ile ilişkili olup olmadığını daha da belirlemek amacıyla, anahtar molekül protein ekspresyon seviyelerini ve ASC oligomerizasyon seviyelerini belirlemek için alfa-2 ve alfa-7.3 giardinleri fare peritoneal makrofajlarına transfekte ettik ve her iki a-giardinin aktive olduğunu doğruladık. iltihaplı NLRP3.Sonuçlarımız, Caco-2 hücrelerinin G. muris veya E. coli EPEC suşları ile uyarılmasının tek başına NLRP3, ASC ve kaspaz-1'in floresans yoğunluğunu artırabileceğini bildiren Manko-Prykhoda ve ark.'nın sonuçlarından biraz farklıdır. anlamlı olmasa da, G. muris ve E. coli'nin birlikte uyarılmasının üç proteinin düzeylerini nasıl artırdığı araştırılmıştır [49].Bu tutarsızlık Giardia türlerinin, hücre çizgilerinin ve birincil hücrelerin seçimindeki farklılıklardan kaynaklanıyor olabilir.Ayrıca G. duodenalis'e daha duyarlı olan 5 haftalık dişi WT C57BL/6 farelerinde MCC950 kullanarak in vivo analizler gerçekleştirdik.MCC950, nanomolar konsantrasyonlarda kanonik ve kanonik olmayan NLRP3 aktivasyonunu bloke eden güçlü ve seçici bir küçük moleküllü NLRP3 inhibitörüdür.MCC950, NLRP3 aktivasyonunu inhibe eder ancak AIM2, NLRC4 ve NLRP1 inflamatuar yollarının veya TLR sinyal yollarının aktivasyonunu etkilemez [27].MCC950, NLRP3 aktivasyonunu bloke eder ancak NLRP3 başlatılmasını, K+ akışını, Ca2+ akışını veya NLRP3 ile ASC arasındaki etkileşimi engellemez;bunun yerine ASC oligomerizasyonunu bloke ederek NLRP3 inflamatuar aktivasyonunu inhibe eder [27].Bu nedenle, giardin enjeksiyonundan sonra NLRP3 inflamatuarının rolünü belirlemek için in vivo bir çalışmada MCC950'yi kullandık.Aktive edilmiş kaspaz-1 p10, proinflamatuar sitokinler pro-IL-1β ve pro-IL-18'i olgun IL-1β ve IL-18'e ayırır [50].Bu çalışmada, MCC950'li veya MCC950'siz giardinle tedavi edilen farelerdeki serum IL-1β seviyeleri, NLRP3 inflamatuarının aktive olup olmadığının bir göstergesi olarak kullanıldı.Beklendiği gibi, MCC950 tedavisi serum IL-1β düzeylerini önemli ölçüde azalttı.Bu veriler G. duodenalis giardin alfa-2 ve giardin alfa-7.3'ün NLRP3 fare inflamatuarını aktive edebildiğini açıkça göstermektedir.
Geçtiğimiz on yılda biriken önemli veriler, IL-17A'nın, G. muris'e karşı bağışıklığın ana düzenleyicisi olduğunu, IL-17RA sinyalini indüklediğini, antimikrobiyal peptitler ürettiğini ve kompleman aktivasyonunu düzenlediğini göstermiştir [51].Bununla birlikte, Giardia enfeksiyonu genç yetişkinlerde daha sık görülür ve genç farelerde Giardia enfeksiyonunun koruyucu etkisini göstermek için IL-17A yanıtını aktive etmediği rapor edilmiştir [52], bu da araştırmacıları diğer immünomodülatör Giardia'ları aramaya sevk etmiştir.Helmint enfeksiyonunun mekanizmaları.Yakın zamanda yapılan bir çalışmanın yazarları, G. muris'in, antimikrobiyal peptitlerin üretimini teşvik eden ve bağırsak kanalındaki bağlanma kapasitesini ve trofozoit sayısını azaltan, böylece kolonun ciddiyetini azaltan, E. coli EPEC tarafından sağlanan NLRP3 inflamatuarını aktive edebildiğini bildirdi. basillerin neden olduğu hastalıklar [49 ].NLRP3 inflamatuarı çeşitli hastalıkların gelişiminde rol oynar.Çalışmalar, Pseudomonas aeruginosa'nın hücre ölümünü önlemek için makrofajlarda otofajiyi tetiklediğini ve bu sürecin NLRP3 inflamatuarının aktivasyonuna bağlı olduğunu göstermiştir [53].N. caninum için, NLRP3 inflamatuarının reaktif oksijen türlerinin aracılık ettiği aktivasyonu, konakçıdaki replikasyonunu sınırlayarak onu potansiyel bir terapötik hedef haline getirir [9].Paracoccidioides brasiliensis'in, fare kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerde NLRP3 inflamatuarının aktivasyonunu indüklediği, bunun da konak savunmasında kritik bir rol oynayan inflamatuar sitokin IL-1β'nın salınmasına yol açtığı bulunmuştur [10].L. amazonensis, L. major, L. braziliensis ve L. infantum chagasi dahil olmak üzere birçok Leishmania türü, Leishmania enfeksiyonunun yanı sıra makrofajlarda NLRP3 ve ASC'ye bağımlı kaspaz-1'i aktive eder.NLRP3/ASC/kaspaz-1 geni eksik olan farelerde parazit replikasyonu arttırılmıştır [11].Zamboni ve ark.Leishmania enfeksiyonunun, hücre içi parazit replikasyonunu sınırlayan makrofajlarda NLRP3 inflamatuarının aktivasyonunu indüklediği rapor edilmiştir.Dolayısıyla Leishmania, bir kaçınma stratejisi olarak NLRP3 aktivasyonunu inhibe edebilir.İn vivo çalışmalarda NLRP3 inflamatuarı Leishmania'nın ortadan kaldırılmasına katkıda bulunmuştur ancak dokuları etkilememiştir [54].Tersine, helmintiazis çalışmalarında, NLRP3 inflamatuarının aktivasyonu, konağın gastrointestinal helmintiazise karşı koruyucu bağışıklığını baskılamıştır [12].Shigella dünya çapında ishale neden olan başlıca bakterilerden biridir.Bu bakteriler, P2X7 reseptörünün aracılık ettiği K+ akışı, reaktif oksijen türleri, lizozomal asitleşme ve mitokondriyal hasar yoluyla IL-1β üretimini indükleyebilir.NLRP3 inflamatuarı, makrofajların Shigella'ya karşı fagositozu ve bakterisidal aktivitesini negatif olarak düzenler [55].Plasmodium çalışmaları, Plasmodium ile enfekte edilmiş AIM2, NLRP3 veya kaspaz-1 eksikliği olan farelerin yüksek düzeyde tip 1 interferon ürettiğini ve Plasmodium enfeksiyonuna karşı daha dirençli olduğunu göstermiştir [56].Ancak alfa-2 giardinin ve alfa-7.3 giardinin farelerde NLRP3 enflamasyonunun patojenik aktivasyonunu indüklemedeki rolü belirsizdir.
Bu çalışmada, NLRP3 inflamatuarının MCC950 tarafından inhibisyonu, farelerde BW'yi azalttı ve bağırsak lavaj sıvısındaki trofozoit sayısını arttırdı, bu da duodenal dokuda daha ciddi patolojik değişikliklere yol açtı.Alfa-2 giardin ve alfa-7.3 giardin, konakçı fare NLRP3 inflamatuarını aktive eder, fare vücut ağırlığını arttırır, bağırsak lavaj sıvısındaki trofozoit sayısını azaltır ve patolojik duodenal lezyonları hafifletir.Bu sonuçlar, G. duodenalis'in, alfa-2 giardin ve alfa-7,3 giardin yoluyla NLRP3 konakçı inflamatuarını aktive edebildiğini ve farelerde G. duodenalis'in patojenitesini azalttığını göstermektedir.
Toplu olarak sonuçlarımız, alfa-2 ve alfa-7.3 giardinlerin, NLRP3 konakçı inflamatuarının aktivasyonunu indüklediğini ve farelerde G. duodenalis'in enfektivitesini azalttığını göstermektedir.Bu nedenle bu moleküller giardiasisin önlenmesinde umut verici hedeflerdir.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: genel bakış.Geçtiğimiz günlerde Pat Inflamm'ın ilaçlara alerjisi olduğu ortaya çıktı.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: farmakoterapinin gözden geçirilmesi.Bir eczacının uzman görüşü.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, ilaç direnci ve yeni hedeflerin keşfi.Disord ilaç hedeflerini enfekte eder.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, vb. NLRP3 inflamatuar ve inflamatuar hastalıklar.Oksit Med Hücresi Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Bağırsak iltihabı ve kanserde inflamatuarın rolü.Gastroenteroloji.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Bağışıklık toleransı ve bağırsak iltihabının kavşağında kanonik ve atipik NLRP3 inflamatuar aktivasyonu.bağışıklık öncesi.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, ve diğerleri.ROS aracılı NLRP3 inflamatuar aktivasyonu, N. caninum enfeksiyonuna yanıt olarak rol oynar.Parazit vektörü.2020;13:449.