Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada desteğin devamını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan oluşturacağız.
Toxoplasma gondii, enfekte konağın mikro ortamını modüle eden hücre içi bir protozoan parazittir ve beyin tümörü büyümesi insidansı ile ilişkili olduğu bilinmektedir.Bu çalışmada Toksoplazma enfeksiyonundan kaynaklanan eksozomal miRNA-21'in beyin tümörü büyümesini desteklediğini varsayıyoruz.Toksoplazma ile enfekte olmuş BV2 mikrogliadan gelen eksozomlar karakterize edildi ve U87 glioma hücrelerinin içselleştirilmesi doğrulandı.Eksozomal mikroRNA ekspresyon profilleri, Toxoplasma gondii ve tümör sınıflandırmasıyla ilişkili mikroRNA ve mikroRNA-21A-5p dizileri kullanılarak analiz edildi.Ayrıca eksozomlardaki miR-21 seviyelerini değiştirerek U87 glioma hücrelerinde tümörle ilişkili genlerin mRNA seviyelerini ve eksozomların insan U87 glioma hücre proliferasyonu üzerindeki etkisini araştırdık.Toxoplasma gondii ile enfekte olmuş U87 glioma hücrelerinin eksozomlarında, microRNA-21 ekspresyonu artar ve antitümör genlerinin (FoxO1, PTEN ve PDCD4) aktivitesi azalır.Toksoplazma ile enfekte olmuş BV2'den türetilmiş eksozomlar, U87 glioma hücrelerinin çoğalmasına neden olur.Eksozomlar, bir fare tümör modelinde U87 hücrelerinin büyümesini indükler.Toksoplazma ile enfekte olmuş BV2 mikrogliasında artan eksozomal miR-21'in, antitümör genlerini aşağı doğru düzenleyerek U87 glioma hücrelerinde bir hücre büyüme destekleyicisi olarak önemli bir rol oynayabileceğini öneriyoruz.
2018 yılında dünya çapında 18,1 milyondan fazla ileri kanser vakasının teşhis edildiği ve her yıl yaklaşık 297.000 merkezi sinir sistemi tümörünün (tüm tümörlerin %1,6'sı) teşhis edildiği tahmin edilmektedir1.Önceki araştırmalar, insan beyni tümörlerinin gelişimi için risk faktörlerinin çeşitli kimyasal ürünler, aile geçmişi ve kafa tedavi ve teşhis ekipmanlarından gelen iyonlaştırıcı radyasyonu içerdiğini göstermiştir.Ancak bu malignitelerin kesin nedeni bilinmemektedir.Dünya çapındaki tüm kanserlerin yaklaşık %20'sine virüsler, bakteriler ve parazitler dahil olmak üzere bulaşıcı ajanlar neden olmaktadır3,4.Bulaşıcı patojenler, konakçı hücrenin DNA onarımı ve hücre döngüsü gibi genetik mekanizmalarını bozar ve kronik inflamasyona ve bağışıklık sisteminde hasara yol açabilir5.
İnsan kanseriyle ilişkili bulaşıcı ajanlar, insan papillomavirüsleri ve hepatit B ve C virüsleri dahil olmak üzere en yaygın viral patojenlerdir.Parazitler aynı zamanda insan kanserinin gelişiminde de potansiyel bir rol oynayabilir.Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis ve Hymenolepis nana gibi çeşitli parazit türlerinin çeşitli insan kanseri türleriyle ilişkilendirilmiştir6,7,8.
Toxoplasma gondii, enfekte konakçı hücrelerin mikro ortamını düzenleyen hücre içi bir protozoondur.Bu parazitin dünya nüfusunun yaklaşık %30'unu enfekte ettiği ve tüm nüfusu riske attığı tahmin edilmektedir9,10.Toxoplasma gondii, merkezi sinir sistemi (CNS) de dahil olmak üzere hayati organları enfekte edebilir ve özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda ölümcül menenjit ve ensefalit gibi ciddi hastalıklara neden olabilir9.Bununla birlikte Toxoplasma gondii, bağışıklık sistemi yeterli bireylerde hücre büyümesini ve bağışıklık tepkilerini modüle ederek enfekte olmuş konağın ortamını da değiştirebilir, bu da asemptomatik bir kronik enfeksiyonun sürdürülmesine yol açabilir9,11.İlginç bir şekilde, T. gondii yaygınlığı ile beyin tümörü görülme sıklığı arasındaki korelasyon göz önüne alındığında, bazı raporlar kronik T. gondii enfeksiyonuna bağlı in vivo konakçı çevresel değişikliklerinin tümör mikro ortamına benzediğini ileri sürmektedir.
Eksozomlar, komşu hücrelerden proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere biyolojik içerik sağlayan hücreler arası iletişimciler olarak bilinir16,17.Eksozomlar, tümör mikroçevresindeki anti-apoptoz, anjiyogenez ve metastaz gibi tümörle ilişkili biyolojik süreçleri etkileyebilir.Özellikle, yaklaşık 22 nükleotit uzunluğunda kodlamayan küçük RNA'lar olan miRNA'lar (miRNA'lar), miRNA kaynaklı susturma kompleksi (miRISC) aracılığıyla insan mRNA'sının %30'undan fazlasını kontrol eden önemli transkripsiyon sonrası gen düzenleyicileridir.Toxoplasma gondii, enfekte konakçılarda miRNA ekspresyonunu kontrol ederek biyolojik süreçleri bozabilir.Konakçı miRNA'ları, parazitin hayatta kalma stratejisini gerçekleştirmek için konakçının biyolojik süreçlerini düzenlemek için önemli sinyaller içerir.Bu nedenle, T. gondii enfeksiyonu sonrasında konakçı miRNA profilindeki değişiklikleri incelemek, konakçı ile T. gondii arasındaki etkileşimi daha net bir şekilde anlamamıza yardımcı olabilir.Gerçekten de Thirugnanam ve ark.15, T. gondii'nin, tümör büyümesiyle ilişkili spesifik konakçı miRNA'ları üzerindeki ekspresyonunu değiştirerek beyin karsinogenezini teşvik ettiğini öne sürdü ve T. gondii'nin deney hayvanlarında gliomalara neden olabileceğini buldu.
Bu çalışma, Toxoplasma BV2 ile enfekte olmuş konakçı mikrogliadaki eksozomal miR-21'in değişimine odaklanmaktadır.Aşırı eksprese edilen miR-21'in hedefi olan FoxO1/p27'nin çekirdeğinde tutulması nedeniyle U87 glioma hücrelerinin büyümesinde değiştirilmiş eksozomal miR-21'in olası bir rolünü gözlemledik.
BV2'den türetilen eksozomlar, diferansiyel santrifüjleme kullanılarak elde edildi ve hücresel bileşenler veya diğer keseciklerle kontaminasyonu önlemek için çeşitli yöntemlerle doğrulandı.SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), BV2 hücrelerinden ve eksozomlardan ekstrakte edilen proteinler arasında farklı desenler gösterdi (Şekil 1A) ve numuneler, eksozomal protein belirteçlerinin Western blotlanmasıyla analiz edilen Alix'in varlığı açısından değerlendirildi.Alix etiketlemesi eksozom proteinlerinde bulundu ancak BV2 hücre lizat proteinlerinde bulunamadı (Şekil 1B).Ek olarak BV2'den türetilen eksozomlardan saflaştırılmış RNA, bir biyoanalizör kullanılarak analiz edildi.Eksozomal RNA göç modelinde 18S ve 28S ribozomal alt birimleri nadiren gözlendi, bu da güvenilir saflığı gösterir (Şekil 1C).Son olarak, transmisyon elektron mikroskobu, gözlemlenen eksozomların yaklaşık 60-150 nm boyutunda olduğunu ve eksozom morfolojisine özgü fincan benzeri bir yapıya sahip olduğunu gösterdi (Şekil 1D).
BV2 hücrelerinden türetilen eksozomların karakterizasyonu.(A) Güvenlik veri sayfası sayfası.Proteinler BV2 hücrelerinden veya BV2'den türetilen eksozomlardan izole edildi.Protein desenleri hücreler ve eksozomlar arasında farklılık gösterir.(B) Bir eksozomal işaretleyicinin (Alix) Western blot analizi.(C) BV2 hücrelerinden ve BV2'den türetilmiş eksozomlardan saflaştırılmış RNA'nın bir biyoanalizör kullanılarak değerlendirilmesi.Bu nedenle BV2 hücrelerindeki 18S ve 28S ribozomal alt birimleri, ekzozomal RNA'da nadiren bulundu.(D) Transmisyon elektron mikroskobu, BV2 hücrelerinden izole edilen eksozomların %2 uranil asetat ile negatif olarak boyandığını gösterdi.Eksozomlar yaklaşık 60-150 nm boyutunda ve fincan şeklindedir (Song ve Jung, yayınlanmamış veriler).
BV2'den türetilmiş eksozomların U87 insan glioma hücrelerine hücresel içselleştirilmesi, konfokal mikroskopi kullanılarak gözlemlendi.PKH26 etiketli eksozomlar, U87 hücrelerinin sitoplazmasında lokalizedir.Çekirdekler DAPI ile boyandı (Şekil 2A), bu, BV2'den türetilmiş eksozomların konakçı hücreler tarafından içselleştirilebileceğini ve alıcı hücrelerin ortamını etkileyebileceğini gösterir.
BV2'den türetilmiş eksozomların U87 glioma hücrelerine içselleştirilmesi ve Toxoplasma RH ile enfekte edilmiş BV2'den türetilmiş eksozomlar, U87 glioma hücrelerinin çoğalmasını tetikledi.(A) Konfokal mikroskopi ile ölçülen U87 hücreleri tarafından yutulan eksozomlar.U87 glioma hücreleri, PKH26 (kırmızı) ile etiketlenmiş veya kontrolsüz eksozomlarla 24 saat boyunca inkübe edildi.Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı ve daha sonra eş odaklı bir mikroskop altında gözlemlendi (ölçek çubuğu: 10 μm, x 3000).(B) U87 glioma hücre proliferasyonu, hücre proliferasyon tahlili ile belirlendi.U87 glioma hücreleri belirtilen süre boyunca eksozomlarla tedavi edildi. *P < 0.05, Öğrenci t testiyle elde edildi. *P < 0.05, Öğrenci t testiyle elde edildi. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *Student t-testine göre P < 0,05. *P < 0.05 t 检验获得。 *P<0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05, Öğrenci t-testi kullanılarak elde edilmiştir.
BV2'den türetilmiş eksozomların U87 glioma hücrelerine içselleştirilmesini doğruladıktan sonra, BV2'den türetilmiş Toksoplazma'dan türetilmiş eksozomların insan glioma hücrelerinin gelişimindeki rolünü araştırmak için hücre proliferasyon analizleri gerçekleştirdik.U87 hücrelerinin, T. gondii ile enfekte olmuş BV2 hücrelerinden alınan eksozomlarla işlenmesi, T. gondii ile enfekte edilmiş BV2'den türetilmiş eksozomların, kontrole kıyasla U87 hücrelerinin önemli ölçüde daha yüksek çoğalmasına neden olduğunu gösterdi (Şekil 2B).
Ek olarak, U118 hücrelerinin büyümesi, U87 ile aynı sonuçlara sahipti; çünkü Toksoplazma tarafından uyarılan eksozomlar, en yüksek çoğalma seviyelerine neden oldu (veriler gösterilmemiştir).Bu verilere dayanarak BV2'den türetilmiş Toksoplazma ile enfekte olmuş eksozomların glioma hücre çoğalmasında önemli bir rol oynadığını gösterebiliriz.
Toksoplazma ile enfekte BV2'den türetilmiş eksozomların tümör gelişimi üzerindeki etkisini araştırmak için, bir ksenograft modeli için çıplak farelere U87 glioma hücrelerini enjekte ettik ve BV2'den türetilmiş eksozomları veya RH ile enfekte BV2'den türetilmiş eksozomları enjekte ettik.1 hafta sonra tümörler belirgin hale geldikten sonra, 5 fareden oluşan her deney grubu, aynı başlangıç ​​noktasını belirlemek için tümör boyutuna göre bölündü ve tümör boyutu 22 gün boyunca ölçüldü.
U87 ksenograft modeline sahip farelerde, 22. günde BV2'den türetilmiş RH ile enfekte eksozom grubunda önemli ölçüde daha büyük tümör boyutu ve ağırlığı gözlendi (Şekil 3A,B).Öte yandan BV2'den türetilmiş eksozom grubu ile eksozom tedavisi sonrasında kontrol grubu arasında tümör boyutunda anlamlı bir fark yoktu.Ek olarak, glioma hücreleri ve eksozomlar enjekte edilen fareler, RH ile enfekte BV2'den türetilmiş eksozomlar grubundaki en büyük tümör hacmini görsel olarak sergiledi (Şekil 3C).Bu sonuçlar, BV2'den türetilmiş Toksoplazma ile enfekte olmuş eksozomların, bir fare tümör modelinde glioma büyümesini indüklediğini göstermektedir.
U87 ksenograft fare modelinde BV2'den türetilmiş eksozomların onkogenezi (AC).Tümör boyutu (A) ve ağırlık (B), BV2'den türetilen RH ile enfekte eksozomlarla tedavi edilen BALB/c çıplak farelerde önemli ölçüde arttı.BALB/c çıplak farelere (C), Matrigel karışımı içinde süspanse edilen 1 x 107 U87 hücresi deri altından enjekte edildi.Enjeksiyondan altı gün sonra farelerde 100 µg BV2'den türetilmiş eksozomlar tedavi edildi.Tümör boyutu ve ağırlığı sırasıyla belirtilen günlerde ve kurban edildikten sonra ölçüldü. *P<0.05. *P<0.05. *Р < 0,05. *P<0.05. *P < 0,05。 *P < 0,05。 *Р < 0,05. *P<0.05.
Veriler, bağışıklık veya tümör gelişimi ile ilişkili 37 miRNA'nın (16'sı aşırı eksprese edilmiş ve 21'i aşağı eksprese edilmiş), Toxoplasma RH suşu ile enfeksiyondan sonra mikroglia'da önemli ölçüde değiştiğini gösterdi (Şekil 4A).Değiştirilmiş miRNA'lar arasında miR-21'in nispi ekspresyon seviyeleri, BV2'den türetilen eksozomlarda, BV2 ve U87 hücreleriyle tedavi edilen eksozomlarda gerçek zamanlı RT-PCR ile doğrulandı.miR-21'in ekspresyonu, Toxoplasma gondii (RH suşu) ile enfekte olmuş BV2 hücrelerinden gelen eksozomlarda önemli bir artış gösterdi (Şekil 4B).BV2 ve U87 hücrelerinde miR-21'in nispi ekspresyon seviyeleri, değiştirilmiş eksozomların alımından sonra arttı (Şekil 4B).Tümör hastalarının ve Toxoplasma gondii (ME49 suşu) ile enfekte olmuş farelerin beyin dokularındaki miR-21 ekspresyonunun göreceli seviyeleri, sırasıyla kontrollerden daha yüksekti (Şekil 4C).Bu sonuçlar, tahmin edilen ve doğrulanan mikroRNA'ların in vitro ve in vivo ekspresyon seviyeleri arasındaki farklarla ilişkilidir.
Toxoplasma gondii (RH) ile enfekte olmuş mikrogliadaki eksozomal miP-21a-5p ifadesindeki değişiklikler.(A) T. gondii RH enfeksiyonunu takiben bağışıklık veya tümör gelişimi ile ilişkili siRNA'da önemli değişiklikler olduğunu gösterir.(B) BV2'den türetilen eksozomlarda, BV2 ile tedavi edilen eksozomlarda ve U87 hücrelerinde gerçek zamanlı RT-PCR ile bağıl miR-21 ekspresyon seviyeleri tespit edildi.(C) Tümör hastalarının (N=3) ve Toxoplasma gondii (ME49 suşu) (N=3) ile enfekte olmuş farelerin beyin dokularında bağıl miR-21 ekspresyon seviyeleri bulundu. *P < 0.05, Öğrenci t testiyle elde edildi. *P < 0.05, Öğrenci t testiyle elde edildi. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0.05, Öğrenci t-testi kullanılarak elde edildi. *P < 0.05 t 检验获得。 *P<0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05, Öğrenci t-testi kullanılarak elde edilmiştir.
RH ile enfekte olmuş BV2 hücrelerinden alınan eksozomlar, in vivo ve in vitro gliomaların büyümesine yol açtı (Şekil 2, 3).İlgili mRNA'ları tespit etmek için, BV2 veya RH BV2'den türetilmiş eksozomlarla enfekte edilmiş U87 hücrelerinde antitümör hedef genlerinin, çatal uçlu kutu O1 (FoxO1), PTEN'in ve programlanmış hücre ölümü 4'ün (PDCD4) mRNA seviyelerini inceledik.Biyoenformatik analiz, FoxO1, PTEN ve PDCD4 genleri de dahil olmak üzere tümörle ilişkili birçok genin miR-2121,22 bağlanma bölgelerine sahip olduğunu göstermiştir.Antitümör hedef genlerinin mRNA seviyeleri, RH ile enfekte olmuş BV2'den türetilmiş eksozomlarda, BV2'den türetilmiş eksozomlara kıyasla azaldı (Şekil 5A).FoxO1, RH ile enfekte olmuş BV2'den türetilmiş eksozomlarda, BV2'den türetilmiş eksozomlara kıyasla düşük protein seviyeleri gösterdi (Şekil 5B).Bu sonuçlara dayanarak, RH ile enfekte olmuş BV2'den türetilen eksozomların, anti-onkogenik genleri aşağı regüle ederek tümör büyümesindeki rollerini koruduklarını doğrulayabiliriz.
Toxoplasma RH ile enfekte BV2'den türetilmiş eksozomlar, U87 glioma hücrelerinde antitümör genlerinin Toxoplasma RH ile enfekte BV2'den türetilmiş eksozomlar tarafından baskılanmasına neden olur.(A) PBS eksozomlarına kıyasla T. gondii RH ile enfekte BV2'den türetilen eksozomlarda FoxO1, PTEN ve PDCD4 ekspresyonunun gerçek zamanlı PCR'si.Kontrol olarak β-aktin mRNA kullanıldı.(B) FoxO1 ekspresyonu Western blot ile belirlendi ve dansitometri verileri ImageJ programı kullanılarak istatistiksel olarak değerlendirildi. *P < 0.05, Öğrenci t testiyle elde edildi. *P < 0.05, Öğrenci t testiyle elde edildi. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0.05, Öğrenci t-testi kullanılarak elde edildi. *P < 0.05 t 检验获得。 *P<0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05, Öğrenci t-testi kullanılarak elde edilmiştir.
Eksozomlardaki miP-21'in tümörle ilişkili gen regülasyonu üzerindeki etkisini anlamak için U87 hücreleri, Lipofectamine 2000 kullanılarak bir miP-21 inhibitörü ile transfekte edildi ve hücreler transfeksiyondan 24 saat sonra toplandı.MiR-21 inhibitörleriyle transfekte edilmiş hücrelerdeki FoxO1 ve p27 ekspresyon seviyeleri, qRT-PCR kullanılarak BV2'den türetilmiş eksozomlarla tedavi edilen hücrelerle karşılaştırıldı (Şekil 6A,B).miR-21 inhibitörünün U87 hücrelerine transfeksiyonu, FoxO1 ve p27 ekspresyonunu önemli ölçüde azalttı (ŞEKİL 6).
RH ile enfekte olmuş eksozomal BV2'den türetilmiş miP-21, U87 glioma hücrelerinde FoxO1 / p27 ekspresyonunu değiştirdi.U87 hücreleri, Lipofectamine 2000 kullanılarak miP-21 inhibitörü ile transfekte edildi ve hücreler, transfeksiyondan 24 saat sonra toplandı.MiR-21 inhibitörleriyle transfekte edilmiş hücrelerdeki FoxO1 ve p27 ekspresyon seviyeleri, qRT-PCR (A, B) kullanılarak BV2'den türetilmiş eksozomlarla tedavi edilen hücrelerdeki seviyelerle karşılaştırıldı.
Konağın bağışıklık tepkisinden kaçmak için Toxoplasma paraziti bir doku kistine dönüşür.Konağın ömrü boyunca beyin, kalp ve iskelet kası dahil olmak üzere çeşitli dokuları parazite ederler ve konağın bağışıklık tepkisini modüle ederler.Ek olarak, konakçı hücrelerin hücre döngüsünü ve apoptozunu düzenleyerek çoğalmalarını teşvik edebilirler14,24.Toxoplasma gondii ağırlıklı olarak konakçı dendritik hücreleri, nötrofilleri ve beyin mikrogliaları da dahil olmak üzere monosit/makrofaj soyunu enfekte eder.Toxoplasma gondii, M2 fenotipindeki makrofajların farklılaşmasını indükler, patojen enfeksiyonundan sonra yara iyileşmesini etkiler ve ayrıca hipervaskülarizasyon ve granülomatöz fibrozis ile de ilişkilidir.Toksoplazma enfeksiyonunun bu davranışsal patogenezi, tümör gelişimi ile ilişkili belirteçlerle ilişkili olabilir.Toksoplazma tarafından düzenlenen düşmanca ortam, karşılık gelen kanser öncüsüne benzeyebilir.Bu nedenle Toksoplazma enfeksiyonunun beyin tümörlerinin gelişimine katkıda bulunması gerektiği varsayılabilir.Aslında çeşitli beyin tümörleri olan hastaların serumunda yüksek oranda Toksoplazma enfeksiyonu rapor edilmiştir.Ek olarak, Toxoplasma gondii başka bir kanserojen efektör olabilir ve diğer bulaşıcı kanserojenlerin beyin tümörleri geliştirmesine yardımcı olmak için sinerjik olarak hareket edebilir.Bu bağlamda P. falciparum ve Epstein-Barr virüsünün Burkitt lenfoma oluşumuna sinerjistik olarak katkıda bulunduğunu belirtmekte fayda var.
Eksozomların kanser araştırmaları alanında düzenleyiciler olarak rolü kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır.Bununla birlikte, eksozomların parazitler ve enfekte konakçılar arasındaki rolü tam olarak anlaşılmamıştır.Şimdiye kadar, salgılanan proteinler de dahil olmak üzere çeşitli düzenleyiciler, protozoan parazitlerin konakçı saldırısına direndiği ve enfeksiyonu sürdürdüğü biyolojik süreçleri açıkladı.Son zamanlarda, protozoonlarla ilişkili mikropartiküllerin ve bunların mikroRNA'larının, hayatta kalmaları için uygun bir ortam yaratmak üzere konakçı hücrelerle etkileşime girdiğine dair büyüyen bir kavram var.Bu nedenle, değiştirilmiş ekzozomal miRNA'lar ile glioma hücre proliferasyonu arasındaki ilişkinin keşfedilmesi için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.MikroRNA değişikliği (küme genleri miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 ve miR-17-92) toksoplazma ile enfekte insan makrofajlarındaki STAT3 promotörüne bağlanır, düzenlenir ve anti Toxoplasma gondii enfeksiyonuna yanıt olarak -apoptoz 29.Toksoplazma enfeksiyonu, çeşitli hiperproliferatif hastalıklarla ilişkili olan miR-17-5p ve miR-106b-5p'nin ekspresyonunu arttırır30.Bu veriler, Toxoplasma enfeksiyonu tarafından düzenlenen konakçı miRNA'larının, konakçının biyolojik davranışında parazitin hayatta kalması ve patogenezi için önemli moleküller olduğunu göstermektedir.
Değiştirilmiş miRNA'lar, gliomalar da dahil olmak üzere kötü huylu hücrelerin başlatılması ve ilerlemesi sırasında çeşitli davranış türlerini etkileyebilir: büyüme sinyallerinin kendi kendine yeterliliği, büyümeyi inhibe eden sinyallere karşı duyarsızlık, apoptozdan kaçınma, sınırsız replikasyon potansiyeli, anjiyogenez, istila ve metastaz ve iltihaplanma.Gliomada, çeşitli ekspresyon profili oluşturma çalışmalarında değiştirilmiş miRNA'lar tanımlanmıştır.
Bu çalışmada toksoplazma ile enfekte olmuş konakçı hücrelerde yüksek düzeyde miRNA-21 ekspresyonunu doğruladık.miR-21, gliomalar da dahil olmak üzere katı tümörlerde en sık aşırı eksprese edilen mikroRNA'lardan biri olarak tanımlanmıştır33 ve ekspresyonu, glioma derecesi ile ilişkilidir.Biriken kanıtlar, miR-21'in, glioma büyümesinde anti-apoptotik bir faktör olarak görev yapan ve insan beyni malignitelerinin dokularında ve plazmasında yüksek oranda aşırı eksprese edilen yeni bir onkogen olduğunu göstermektedir.İlginç bir şekilde, glioma hücrelerinde ve dokularında miR-21'in inaktivasyonu, kaspaz bağımlı apoptoz nedeniyle hücre çoğalmasının inhibisyonunu tetikler.MiR-21 ile tahmin edilen hedeflerin biyoinformatik analizi, miR-2121 bağlanma bölgesi ile programlanmış hücre ölümü 4 (PDCD4), tropomiyosin (TPM1), PTEN ve çatal uçlu kutu O1 (FoxO1) dahil olmak üzere apoptoz yollarıyla ilişkili çok sayıda tümör baskılayıcı geni ortaya çıkardı..22.38.
FoxO1, transkripsiyon faktörlerinden (FoxO) biri olarak, çeşitli insan kanseri türlerinin gelişiminde rol oynar ve p21, p27, Bim ve FasL40 gibi tümör baskılayıcı genlerin ekspresyonunu düzenleyebilir.FoxO1, hücre büyümesini baskılamak için p27 gibi hücre döngüsü inhibitörlerini bağlayabilir ve aktive edebilir.Ayrıca FoxO1, PI3K/Akt sinyallemesinin önemli bir efektörüdür ve p2742 transkripsiyonunun aktivasyonu yoluyla hücre döngüsü ilerlemesi ve hücre farklılaşması gibi birçok biyolojik süreci düzenler.
Sonuç olarak, Toksoplazma ile enfekte olmuş mikrogliadan türetilen eksozomal miR-21'in, glioma hücrelerinin büyüme düzenleyicisi olarak önemli bir rol oynayabileceğine inanıyoruz (Şekil 7).Ancak eksozomal miR-21, değiştirilmiş Toksoplazma enfeksiyonu ve glioma büyümesi arasında doğrudan bir bağlantı bulmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.Bu sonuçların Toksoplazma enfeksiyonu ile glioma görülme sıklığı arasındaki ilişkiyi incelemek için bir başlangıç ​​noktası sağlaması bekleniyor.
Bu çalışmada glioma (beyin) karsinogenezinin mekanizmasının şematik bir diyagramı önerilmiştir.Yazar PowerPoint 2019'da (Microsoft, Redmond, WA) çizim yapıyor.
Hayvanların kullanımı da dahil olmak üzere bu çalışmadaki tüm deney protokolleri, Seul Ulusal Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanıcı Komitesi Standart Etik Yönergelerine uygundu ve Seul Ulusal Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB numarası SNU-) tarafından onaylandı. 150715).-2).Tüm deneysel prosedürler ARRIVE tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
BV2 fare mikroglia ve U87 insan glioma hücreleri, her biri %10 fetal sığır serumu, 4 mM l- içeren, sırasıyla Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamında (DMEM; Welgene, Seul, Kore) ve Roswell Park Memorial Institute Ortamında (RPMI; Welgene) kültürlendi. glutamin, 0,2 mM penisilin ve 0,05 mM streptomisin.Hücreler %5 CO2 içeren bir inkübatörde 37°C'de kültürlendi.Başka bir glioma hücre dizisi olan U118, U87 hücreleriyle karşılaştırma için kullanıldı.
T. gondii ile enfekte olmuş RH ve ME49 suşlarından eksozomları izole etmek için, T. gondii takizoitleri (RH suşu), 3-4 gün önce enjekte edilen 6 haftalık BALB/c farelerinin karın boşluğundan toplandı.Takizoitler üç kez PBS ile yıkandı ve %40 Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD)43 içerisinde santrifüjleme yoluyla saflaştırıldı.ME49 suşunun takizoitlerini elde etmek için BALB/c farelerine 20 doku kisti intraperitoneal olarak enjekte edildi ve enfeksiyondan sonraki 6-8. günde karın boşluğu yıkanarak kistlerdeki takizoit dönüşümü toplandı (PI).Fareler PBS ile enfekte oldu.ME49 takizoitleri, 100 μg/ml penisilin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, ABD), 100 μg/ml streptomisin (Gibco/BRL) ve %5 fetal sığır serumu (Lonza, Walkersville, MD) ile desteklenmiş hücrelerde büyütüldü. .., ABD) 37 °C'de ve %5 karbondioksitte.Vero hücrelerinde ekimden sonra ME49 takizoitleri, birikintileri ve hücreleri çıkarmak için iki kez 25 gauge'lik bir iğneden ve ardından 5 um'lik bir filtreden geçirildi.Yıkandıktan sonra takizoitler PBS44 içerisinde yeniden süspanse edildi.Toxoplasma gondii ME49 türünün doku kistleri, enfekte C57BL/6 farelerinin (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Kore) beyninden izole edilen kistlerin intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla muhafaza edildi.ME49 ile enfekte olmuş farelerin beyinleri, PI'den 3 ay sonra toplandı ve kistleri izole etmek için mikroskop altında kıyıldı.Enfekte olmuş fareler, Seul Ulusal Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde özel patojen içermeyen koşullar (SPF) altında tutuldu.
Toplam RNA, elüsyon adımı için inkübasyon süresi de dahil olmak üzere üreticinin talimatlarına göre miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak BV2'den türetilmiş eksozomlardan, BV2 hücrelerinden ve dokulardan ekstre edildi.RNA konsantrasyonu bir NanoDrop 2000 spektrofotometresinde belirlendi.RNA mikrodizilerinin kalitesi, bir Agilent 2100 biyoanalizörü (Agilent Technologies, Amstelveen, Hollanda) kullanılarak değerlendirildi.
%10 eksozom bakımından fakir FBS içeren DMEM, 100.000 g'de 16 saat boyunca 4°C'de ultrasantrifüjleme yoluyla hazırlandı ve 0.22 um'lik bir filtreden (Nalgene, Rochester, NY, ABD) filtrelendi.5 x 105 BV2 hücreleri, %10 eksozomu tükenmiş FBS ve %1 antibiyotik içeren DMEM'de 37°C'de ve %5 C02'de kültürlendi.24 saatlik inkübasyonun ardından RH veya ME49 (MOI = 10) suşunun takizoitleri hücrelere ilave edildi ve istilacı olmayan parazitler bir saat içinde çıkarıldı ve DMEM ile yeniden dolduruldu.BV2 hücrelerinden eksozomlar, en yaygın kullanılan yöntem olan değiştirilmiş diferansiyel santrifüjleme ile izole edildi.RNA veya protein analizi için eksozom peletini 300 ul PBS içerisinde yeniden süspanse edin.İzole edilmiş eksozomların konsantrasyonu, bir BCA protein tahlil kiti (Pierce, Rockford, IL, ABD) ve bir NanoDrop 2000 spektrofotometre kullanılarak belirlendi.
BV2 hücrelerinden veya BV2'den türetilen eksozomlardan elde edilen çökeltiler, PRO-PREP™ protein ekstraksiyon çözeltisinde (iNtRon Bioteknoloji, Seongnam, Kore) parçalandı ve proteinler, Coomassie parlak mavi lekeli %10 SDS poliakrilamid jellerine yüklendi.Ayrıca proteinler 2 saat süreyle PVDF membranlara aktarıldı.Western blotlar, eksozomal bir işaretleyici olarak Alix antikoru (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ABD) kullanılarak doğrulandı.İkincil antikor olarak HRP-konjuge keçi anti-fare IgG (H + L) (Betil Laboratories, Montgomery, TX, ABD) ve bir LAS-1000 plus ışıldayan görüntü analizörü (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japonya) kullanıldı..Eksozomların boyutunu ve morfolojisini incelemek için transmisyon elektron mikroskobu yapıldı.BV2 hücrelerinden izole edilen eksozomlar (6,40 µg/μl), karbon kaplı ağlar üzerinde hazırlandı ve 1 dakika boyunca %2 uranil asetat ile negatif olarak boyandı.Hazırlanan numuneler, ES1000W Erlangshen CCD kamera (Gatan, Pleasanton, CA, ABD) ile donatılmış bir JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japonya) kullanılarak 80 kV hızlanma voltajında ​​​​gözlendi.
BV2'den türetilmiş eksozomlar, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PKH26 Kırmızı Floresan Bağlayıcı Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) kullanılarak boyandı.Negatif kontrol olarak PKH26 etiketli eksozomlara (kırmızı) sahip veya eksozom içermeyen 2x105 U87 hücreleri, %5 CO2 inkübatöründe 24 saat boyunca 37°C'de inkübe edildi.U87 hücre çekirdekleri DAPI (mavi) ile boyandı, U87 hücreleri 15 dakika boyunca 4°C'de %4 paraformaldehid içerisinde sabitlendi ve daha sonra bir Leica TCS SP8 STED CW konfokal mikroskop sisteminde (Leica Microsystems, Mannheim, Almanya) analiz edildi.gözlemlenebilir.
cDNA, Mir-X siRNA birinci iplik sentezi ve SYBR qRT-PCR kiti (Takara Bio Inc., Shiga, Japonya) kullanılarak siRNA'dan sentezlendi.Gerçek zamanlı kantitatif PCR, SYBR Premix ile karıştırılmış primerler ve şablonlar kullanılarak iQ5 gerçek zamanlı PCR tespit sistemi (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi.DNA, 95°C'de 15 saniye süreyle 40 denatürasyon döngüsü ve 60°C'de 60 saniye süreyle tavlama yoluyla çoğaltıldı.Her PCR reaksiyonundan elde edilen veriler, iQ™5 optik sistem yazılımının (Bio-Rad) veri analiz modülü kullanılarak analiz edildi.Seçilen hedef genler ile β-aktin/siRNA (ve U6) arasındaki gen ifadesindeki nispi değişiklikler, standart eğri yöntemi kullanılarak hesaplandı.Kullanılan primer dizileri Tablo 1'de gösterilmektedir.
3 x 104 U87 glioma hücresi, 96 oyuklu plakalara ekildi ve 12, 18 ve 36 saatte kontrol olarak BV2'den (50 μg/mL) türetilmiş Toksoplazma ile enfekte olmuş eksozomlarla veya BV2'den (50 μg/mL) türetilmiş atımsız eksozomlarla karıştırıldı. .Hücre proliferasyon hızı, Hücre Sayım Kiti-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonya) (Ek Şekiller S1-S3)46 kullanılarak belirlendi.
5 haftalık dişi BALB/c çıplak fareler, Orient Bio'dan (Seongnam-si, Güney Kore) satın alındı ​​ve oda sıcaklığında (22±2°C) ve nemde (45±15°C) steril kafeslerde ayrı ayrı tutuldu.%) oda sıcaklığında (22±2°C) ve nemde (%45±15).SPF (Seul Ulusal Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Merkezi) kapsamında 12 saatlik ışık döngüsü ve 12 saatlik karanlık döngüsü gerçekleştirildi.Fareler rastgele her biri 5 fareden oluşan üç gruba ayrıldı ve tüm gruplara 1 x 107 U87 glioma hücresi ve büyüme faktörü azaltılmış BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, ABD) içeren 400 ml PBS deri altından enjekte edildi.Tümör enjeksiyonundan altı gün sonra, BV2 hücrelerinden türetilmiş 200 mg eksozom (Toksoplazma enfeksiyonu olan/olmayan) tümör bölgesine enjekte edildi.Tümör enfeksiyonundan yirmi iki gün sonra, her gruptaki farelerin tümör boyutu haftada üç kez kumpasla ölçüldü ve tümör hacmi şu formülle hesaplandı: 0,5x(genişlik)x2xuzunluk.
miRCURYTM LNA miRNA dizisi, 7. nesil kullanılarak yapılan mikroRNA ekspresyon analizi, 3100 insan, fare ve sıçan miRNA yakalama probları arasında 1119 iyi karakterize edilmiş fareyi kapsayan mmu ve rno dizilerine (EXIQON, Vedbaek, Danimarka) sahiptir.Bu prosedür sırasında, dana bağırsağı alkalin fosfataz ile işleme tabi tutularak ve ardından Hy3 yeşil floresan boya ile etiketlenerek 5'-fosfattan 250 ila 1000 ng toplam RNA çıkarıldı.Etiketli numuneler daha sonra bir hibridizasyon odası kiti (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD) ve bir hibridizasyon slayt kiti (Agilent Technologies) kullanılarak mikrodizi slaytları yüklenerek hibridize edildi.Hibridizasyon 16 saat boyunca 56°C'de gerçekleştirildi, ardından mikrodiziler üreticinin tavsiyelerine uygun olarak yıkandı.İşlenen mikrodizi slaytları daha sonra Agilent G2565CA mikrodizi tarayıcı sistemi (Agilent Technologies) kullanılarak tarandı.Taranan görüntüler, Agilent Özellik Çıkarma yazılımı sürüm 10.7.3.1 (Agilent Technologies) kullanılarak içe aktarıldı ve her görüntünün floresans yoğunluğu, değiştirilmiş Exiqon protokolünün karşılık gelen GAL dosyası kullanılarak ölçüldü.Mevcut çalışmaya ait mikrodizi verileri GEO veritabanında GPL32397 erişim numarası altında saklanmaktadır.
Toksoplazma ile enfekte olmuş RH veya ME49 suşlarının mikrogliasındaki olgun eksozomal miRNA'ların ekspresyon profilleri, çeşitli ağ araçları kullanılarak analiz edildi.Tümör gelişimi ile ilişkili miRNA'lar, miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) kullanılarak tanımlandı ve 8,0'dan büyük normalleştirilmiş sinyal yoğunluğu (log2) ile filtrelendi.MiRNA'lar arasında, diferansiyel olarak eksprese edilen miRNA'ların, T. gondii ile enfekte olmuş RH veya ME49 suşları tarafından değiştirilen miRNA'ların filtre analizi ile 1,5 kattan fazla değiştirilmiş olduğu bulundu.
Hücreler, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak opti-MEM'de (Gibco, Carlsbad, CA, ABD) altı oyuklu plakalara (3 x 105 hücre/oyuk) ekildi.Transfekte edilmiş hücreler 6 saat boyunca kültürlendi ve daha sonra ortam, taze tam ortamla değiştirildi.Hücreler transfeksiyondan 24 saat sonra toplandı.
İstatistiksel analiz esas olarak Excel yazılımı (Microsoft, Washington, DC, ABD) ile Öğrenci t-testi kullanılarak yapıldı.Deneysel hayvan analizi için Prism 3.0 yazılımı (GraphPad Software, La Jolla, CA, ABD) kullanılarak iki yönlü bir ANOVA gerçekleştirildi. P değerleri <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. P değerleri < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P değerleri <0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P=0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P değerleri <0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Bu çalışmada kullanılan tüm deney protokolleri, Seul Ulusal Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB numarası SNU-150715-2) tarafından onaylandı.
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. ve diğerleri.2018'de tahmini küresel kanser insidansı ve ölüm oranı: GLOBOCAN kaynakları ve yöntemleri.Tercüme.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Beyin tümörlerinin risk faktörlerine ve bunların terapötik müdahalelerine ilişkin bir bakış. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Beyin tümörlerinin risk faktörlerine ve bunların terapötik müdahalelerine ilişkin bir bakış.Rashid, S., Rehman, K. ve Akash, MS Beyin tümörleri için risk faktörlerinin ve önemli terapötik müdahalelerin gözden geçirilmesi. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Beyin tümörü risk faktörlerinin ve terapötik müdahalelerin derinlemesine anlaşılması.Rashid, S., Rehman, K. ve Akash, MS Beyin tümörleri için risk faktörlerinin ve önemli terapötik müdahalelerin gözden geçirilmesi.Biyomedikal Bilim.Eczacı.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. İnsan orodigestif ve kadın genital sistem kanserlerinde bakteriyel-viral etkileşimler: Epidemiyolojik ve laboratuvar kanıtlarının bir özeti. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. İnsan orodigestif ve kadın genital sistem kanserlerinde bakteriyel-viral etkileşimler: Epidemiyolojik ve laboratuvar kanıtlarının bir özeti.Kato I., Zhang J. ve Sun J. İnsan gastrointestinal sistemi ve kadın genital sistemi kanserinde bakteriyel-viral etkileşimler: epidemiyolojik ve laboratuvar verilerinin bir özeti. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. evet. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. İnsan ağız boşluğu sindiriminde ve kadın üreme sisteminde bakteri-viral etkileşim: popüler hastalık biliminin ve laboratuvar kanıtlarının özeti.Kato I., Zhang J. ve Sun J. İnsan gastrointestinal kanserinde ve kadın genital kanserinde bakteriyel-viral etkileşimler: epidemiyolojik ve laboratuvar verilerinin bir özeti.Kanser 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Enfeksiyondan kansere: DNA tümör virüsleri konakçı hücrenin merkezi karbonunu ve lipit metabolizmasını nasıl değiştirir. Magon, KL & Parish, JL Enfeksiyondan kansere: DNA tümör virüsleri konakçı hücrenin merkezi karbonunu ve lipit metabolizmasını nasıl değiştirir.Mahon, KL ve Parish, JL Yangından kansere enfeksiyon: DNA bazlı tümör virüsleri, konakçı hücre merkezi karbonunu ve lipit metabolizmasını nasıl değiştirir. Magon, KL & Parish, JL: DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL Enfeksiyondan kansere: DNA tümör virüsleri konakçı hücrenin merkezi karbonunu ve lipit metabolizmasını nasıl değiştirir.Mahon, KL ve Parish, JL Ateşten kansere enfeksiyon: DNA tümör virüsleri, konakçı hücrelerdeki merkezi karbon ve lipit metabolizmasını nasıl değiştirir.Biyolojiyi açın.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM ve diğerleri.Şistozomların ve karaciğer parazitlerinin ve helmint ile ilişkili kanserin katekol östrojenleri.ön.içerisi sıcak.5, 444 (2014).