Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullanmakta olduğunuz tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan yapacağız.
Toxoplasma gondii, enfekte konakçının mikroçevresini modüle eden ve beyin tümörü büyümesi insidansı ile ilişkili olduğu bilinen hücre içi bir protozoan parazittir.Bu çalışmada, Toxoplasma enfeksiyonundan eksozomal miRNA-21'in beyin tümörü büyümesini desteklediğini varsayıyoruz.Toksoplazma ile enfekte BV2 mikrogliadan eksozomlar karakterize edildi ve U87 glioma hücrelerinin içselleştirilmesi doğrulandı.Eksozomal mikroRNA ifade profilleri, Toxoplasma gondii ve tümör sınıflandırması ile ilişkili mikroRNA ve mikroRNA-21A-5p dizileri kullanılarak analiz edildi.Ayrıca eksozomlardaki miR-21 seviyelerini değiştirerek U87 glioma hücrelerinde tümörle ilişkili genlerin mRNA seviyelerini ve eksozomların insan U87 glioma hücre proliferasyonu üzerindeki etkisini araştırdık.Toxoplasma gondii ile enfekte olmuş U87 glioma hücrelerinin eksozomlarında microRNA-21 ekspresyonu artar ve antitümör genlerin (FoxO1, PTEN ve PDCD4) aktivitesi azalır.Toksoplazma ile enfekte olmuş BV2'den türetilen eksozomlar, U87 glioma hücrelerinin çoğalmasını indükler.Eksozomlar, bir fare tümör modelinde U87 hücrelerinin büyümesini indükler.Toxoplasma ile enfekte BV2 mikroglia'da artan eksozomal miR-21'in, antitümör genlerini aşağı doğru düzenleyerek U87 glioma hücrelerinde bir hücre büyümesi promotörü olarak önemli bir rol oynayabileceğini öneriyoruz.
2018 yılında dünya çapında 18,1 milyondan fazla ilerlemiş kanser vakasının teşhis edildiği ve her yıl yaklaşık 297.000 merkezi sinir sistemi tümörü teşhis edildiği tahmin edilmektedir (tüm tümörlerin %1,6'sı)1.Önceki araştırmalar, insan beyin tümörlerini geliştirmek için risk faktörlerinin çeşitli kimyasal ürünleri, aile öyküsünü ve baş terapötik ve teşhis ekipmanından iyonlaştırıcı radyasyonu içerdiğini göstermiştir.Bununla birlikte, bu malignitelerin kesin nedeni bilinmemektedir.Dünya çapındaki tüm kanserlerin yaklaşık %20'sine virüsler, bakteriler ve parazitler3,4 dahil enfeksiyöz ajanlar neden olmaktadır.Enfeksiyöz patojenler, konakçı hücrenin DNA onarımı ve hücre döngüsü gibi genetik mekanizmalarını bozar ve kronik enflamasyona ve bağışıklık sisteminde hasara yol açabilir5.
İnsan kanseri ile ilişkili enfeksiyöz ajanlar, insan papilloma virüsleri ve hepatit B ve C virüsleri dahil olmak üzere en yaygın viral patojenlerdir.Parazitler ayrıca insan kanserinin gelişiminde potansiyel bir rol oynayabilir.Çeşitli parazit türleri, yani Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis ve Hymenolepis nana, çeşitli insan kanseri türleriyle ilişkilendirilmiştir 6,7,8.
Toxoplasma gondii, enfekte konakçı hücrelerin mikroçevresini düzenleyen hücre içi bir protozoandır.Bu parazitin dünya nüfusunun yaklaşık %30'unu enfekte ettiği ve tüm nüfusu riske attığı tahmin edilmektedir9,10.Toxoplasma gondii, merkezi sinir sistemi (CNS) dahil olmak üzere hayati organları enfekte edebilir ve özellikle bağışıklığı baskılanmış hastalarda ölümcül menenjit ve ensefalit gibi ciddi hastalıklara neden olabilir9.Bununla birlikte, Toxoplasma gondii, bağışıklık sistemi yeterli bireylerde hücre büyümesini ve bağışıklık tepkilerini modüle ederek enfekte konağın ortamını da değiştirebilir ve bu da asemptomatik bir kronik enfeksiyonun korunmasına yol açar9,11.İlginç bir şekilde, T. gondii prevalansı ile beyin tümörü insidansı arasındaki korelasyon göz önüne alındığında, bazı raporlar, kronik T. gondii enfeksiyonuna bağlı in vivo konakçı çevresel değişikliklerinin tümör mikroçevresine benzediğini öne sürmektedir.
Eksozomlar, komşu hücrelerden proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere biyolojik içerik sağlayan hücreler arası iletişimciler olarak bilinirler16,17.Eksozomlar, tümör mikroçevresinde anti-apoptoz, anjiyogenez ve metastaz gibi tümörle ilişkili biyolojik süreçleri etkileyebilir.Özellikle, yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda kodlayıcı olmayan küçük RNA'lar olan miRNA'lar (miRNA'lar), miRNA kaynaklı susturma kompleksi (miRISC) aracılığıyla insan mRNA'sının %30'undan fazlasını kontrol eden önemli transkripsiyon sonrası gen düzenleyicileridir.Toxoplasma gondii, enfekte konakçılarda miRNA ekspresyonunu kontrol ederek biyolojik süreçleri bozabilir.Konak miRNA'ları, parazitin hayatta kalma stratejisini gerçekleştirmek için konak biyolojik süreçlerini düzenlemek için önemli sinyaller içerir.Bu nedenle, T. gondii ile enfeksiyon üzerine konakçı miRNA profilindeki değişiklikleri incelemek, konakçı ile T. gondii arasındaki etkileşimi daha net anlamamıza yardımcı olabilir.Nitekim, Thirugnanam ve ark.15, T. gondii'nin, tümör büyümesi ile ilişkili spesifik konakçı miRNA'lar üzerindeki ekspresyonunu değiştirerek beyin karsinojenezini desteklediğini ileri sürmüş ve T. gondii'nin deney hayvanlarında gliomalara neden olabildiğini bulmuştur.
Bu çalışma, Toxoplasma BV2 ile enfekte olmuş konakçı mikrogliada ekzozomal miR-21'in değişimine odaklanmaktadır.Aşırı eksprese edilmiş miR-21'in hedefi olan FoxO1/p27'nin çekirdeğinde tutulması nedeniyle U87 glioma hücrelerinin büyümesinde değişmiş eksozomal miR-21'in olası bir rolünü gözlemledik.
BV2'den türetilen eksozomlar, diferansiyel santrifüj kullanılarak elde edildi ve hücresel bileşenler veya diğer veziküller ile kontaminasyonu önlemek için çeşitli yöntemlerle doğrulandı..Alix işaretlemesi, eksozom proteinlerinde bulundu, ancak BV2 hücre lizat proteinlerinde bulunmadı (Şekil 1B).Ek olarak, BV2'den türetilen eksozomlardan elde edilen saflaştırılmış RNA, bir biyoanalizör kullanılarak analiz edildi.Eksozomal RNA göç modelinde 18S ve 28S ribozomal alt birimleri nadiren gözlendi, bu da güvenilir saflığı gösterir (Şekil 1C).Son olarak, transmisyon elektron mikroskobu, gözlemlenen eksozomların yaklaşık 60-150 nm boyutunda olduğunu ve eksozom morfolojisine özgü fincan benzeri bir yapıya sahip olduğunu gösterdi (Şekil 1D).
BV2 hücrelerinden türetilen eksozomların karakterizasyonu.(A) Güvenlik veri sayfası sayfası.Proteinler, BV2 hücrelerinden veya BV2'den türetilen eksozomlardan izole edildi.Protein modelleri hücreler ve eksozomlar arasında farklılık gösterir.(B) Bir ekzozomal işaretleyicinin (Alix) Western blot analizi.(C) Bir biyoanalizör kullanılarak BV2 hücrelerinden ve BV2'den türetilmiş eksozomlardan saflaştırılmış RNA'nın değerlendirilmesi.Bu nedenle, BV2 hücrelerinde 18S ve 28S ribozomal alt birimler, eksozomal RNA'da nadiren bulundu.(D) Transmisyon elektron mikroskobu, BV2 hücrelerinden izole edilen eksozomların %2 uranil asetat ile negatif olarak boyandığını gösterdi.Eksozomlar yaklaşık 60-150 nm boyutunda ve fincan şeklindedir (Song ve Jung, yayınlanmamış veriler).
BV2'den türetilen eksozomların U87 insan glioma hücrelerine hücresel içselleştirilmesi, konfokal mikroskopi kullanılarak gözlendi.PKH26 etiketli eksozomlar, U87 hücrelerinin sitoplazmasında lokalizedir.Çekirdekler, BV2'den türetilen eksozomların konak hücreler tarafından içselleştirilebileceğini ve alıcı hücrelerin ortamını etkileyebileceğini gösteren DAPI (Şekil 2A) ile boyandı.
BV2'den türetilen eksozomların U87 glioma hücrelerine içselleştirilmesi ve Toxoplasma RH ile indüklenen U87 glioma hücrelerinin proliferasyonu ile enfekte BV2'den türetilmiş eksozomlar.(A) Konfokal mikroskopi ile ölçülen U87 hücreleri tarafından yutulan eksozomlar.U87 glioma hücreleri, PKH26 (kırmızı) ile etiketlenmiş eksozomlarla veya kontrolsüz olarak 24 saat inkübe edildi.Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı ve ardından konfokal bir mikroskop altında gözlendi (ölçek çubuğu: 10 μm, x 3000).(B) U87 glioma hücre proliferasyonu, hücre proliferasyon deneyi ile belirlendi.U87 glioma hücreleri, belirtilen süre boyunca eksozomlarla tedavi edildi. *P < 0.05, Student t testi ile elde edilmiştir. *P < 0.05, Student t testi ile elde edilmiştir. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *Student t-testine göre P < 0.05. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05, Student t testi kullanılarak elde edilmiştir.
BV2'den türetilen eksozomların U87 glioma hücrelerine içselleştirilmesini doğruladıktan sonra, BV2'den türetilen Toksoplazmadan türetilen eksozomların insan glioma hücrelerinin gelişimindeki rolünü araştırmak için hücre proliferasyon deneyleri yaptık.U87 hücrelerinin T. gondii ile enfekte BV2 hücrelerinden eksozomlarla işlenmesi, T. gondii ile enfekte BV2'den türetilmiş eksozomların, kontrole kıyasla önemli ölçüde daha yüksek U87 hücrelerinin proliferasyonuna neden olduğunu gösterdi (Şekil 2B).
Ek olarak, Toxoplasma ile uyarılan eksozomlar en yüksek proliferasyon seviyelerine neden olduğundan (veriler gösterilmemiştir), U118 hücrelerinin büyümesi U87 ile aynı sonuçlara sahipti.Bu verilere dayanarak, BV2'den türetilen Toksoplazma ile enfekte olmuş eksozomların glioma hücre çoğalmasında önemli bir rol oynadığını söyleyebiliriz.
Toksoplazma ile enfekte BV2'den türetilmiş eksozomların tümör gelişimi üzerindeki etkisini araştırmak için, bir ksenogreft modeli için çıplak farelere U87 glioma hücreleri enjekte ettik ve BV2'den türetilmiş eksozomlar veya RH ile enfekte olmuş BV2'den türetilmiş eksozomlar enjekte ettik.1 hafta sonra tümörler belirgin hale geldikten sonra, 5 fareden oluşan her bir deney grubu, aynı başlangıç ​​noktasını belirlemek için tümör boyutuna göre bölündü ve 22 gün boyunca tümör boyutu ölçüldü.
U87 ksenogreft modeline sahip farelerde, 22. günde BV2'den türetilen RH ile enfekte olmuş eksozom grubunda önemli ölçüde daha büyük tümör boyutu ve ağırlığı gözlendi (Şekil 3A,B).Öte yandan, eksozom tedavisinden sonra BV2 türevli eksozom grubu ile kontrol grubu arasında tümör boyutunda anlamlı bir fark yoktu.Ek olarak, glioma hücreleri ve eksozomlar enjekte edilen fareler, RH ile enfekte olmuş BV2'den türetilmiş eksozomlar grubunda görsel olarak en büyük tümör hacmini sergiledi (Şekil 3C).Bu sonuçlar, BV2'den türetilen Toksoplazma ile enfekte olmuş eksozomların, bir fare tümör modelinde glioma büyümesini indüklediğini göstermektedir.
Bir U87 ksenogreft fare modelinde BV2'den türetilen eksozomların onkojenezi (AC).Tümör boyutu (A) ve ağırlığı (B), BV2'den türetilen RH ile enfekte olmuş eksozomlarla tedavi edilen BALB/c çıplak farelerde önemli ölçüde arttı.BALB/c çıplak farelere (C), Matrigel karışımı içinde süspanse edilmiş 1 x 107 U87 hücreleri deri altından enjekte edildi.Enjeksiyondan altı gün sonra, farelerde 100 ug BV2 türevli eksozomlar tedavi edildi.Tümör boyutu ve ağırlığı sırasıyla belirtilen günlerde ve kurban edildikten sonra ölçüldü. *P < 0.05. *P < 0.05. *Р < 0,05. *P < 0.05. *P < 0.05。 *P < 0.05。 *Р < 0,05. *P < 0.05.
Veriler, bağışıklık veya tümör gelişimi ile ilişkili 37 miRNA'nın (16 aşırı eksprese edilmiş ve 21 aşağı eksprese edilmiş), Toxoplasma RH suşu ile enfeksiyondan sonra mikrogliada önemli ölçüde değiştiğini gösterdi (Şekil 4A).Değiştirilmiş miRNA'lar arasındaki miR-21'in nispi ekspresyon seviyeleri, BV2'den türetilen eksozomlarda, BV2 ve U87 hücreleriyle işlenmiş eksozomlarda gerçek zamanlı RT-PCR ile doğrulandı.miR-21'in ifadesi, Toxoplasma gondii (RH suşu) ile enfekte olmuş BV2 hücrelerinden eksozomlarda önemli bir artış gösterdi (Şekil 4B).BV2 ve U87 hücrelerinde miR-21'in nispi ekspresyon seviyeleri, değiştirilmiş eksozomların alımından sonra arttı (Şekil 4B).Tümör hastalarının ve Toxoplasma gondii (ME49 suşu) ile enfekte farelerin beyin dokularındaki nispi miR-21 ekspresyon seviyeleri, sırasıyla kontrollerden daha yüksekti (Şekil 4C).Bu sonuçlar, tahmin edilen ve doğrulanan mikroRNA'ların in vitro ve in vivo ekspresyon seviyeleri arasındaki farklarla ilişkilidir.
Toxoplasma gondii (RH) ile enfekte olmuş mikrogliada eksozomal miP-21a-5p ifadesindeki değişiklikler.(A) T. gondii RH enfeksiyonunu takiben bağışıklık veya tümör gelişimi ile ilişkili siRNA'da önemli değişiklikler gösterir.(B) Göreceli miR-21 ekspresyon seviyeleri, BV2'den türetilmiş eksozomlarda, BV2 ile işlenmiş eksozomlarda ve U87 hücrelerinde gerçek zamanlı RT-PCR ile tespit edildi.(C) Tümör hastalarının (N=3) ve Toxoplasma gondii (ME49 suşu) (N=3) ile enfekte olmuş farelerin beyin dokularında göreli miR-21 ekspresyon seviyeleri bulundu. *P < 0.05, Student t testi ile elde edilmiştir. *P < 0.05, Student t testi ile elde edilmiştir. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0.05, Student t testi kullanılarak elde edilmiştir. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05, Student t testi kullanılarak elde edilmiştir.
RH ile enfekte BV2 hücrelerinden eksozomlar, gliomaların in vivo ve in vitro büyümesine yol açtı (Şekil 2, 3).İlgili mRNA'ları saptamak için, BV2 veya RH BV2'den türetilen eksozomlarla enfekte olmuş U87 hücrelerinde antitümör hedef genlerinin, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN'in ve programlanmış hücre ölümü 4'ün (PDCD4) mRNA seviyelerini inceledik.Biyoinformatik analiz, FoxO1, PTEN ve PDCD4 genleri dahil olmak üzere tümörle ilişkili birkaç genin miR-2121,22 bağlanma bölgelerine sahip olduğunu göstermiştir.Antitümör hedef genlerinin mRNA seviyeleri, BV2'den türetilmiş eksozomlara kıyasla RH ile enfekte olmuş BV2'den türetilmiş eksozomlarda azaldı (Şekil 5A).FoxO1, BV2'den türetilmiş eksozomlara kıyasla RH ile enfekte BV2'den türetilmiş eksozomlarda düşük protein seviyeleri gösterdi (Şekil 5B).Bu sonuçlara dayanarak, RH ile enfekte BV2'den türetilen eksozomların anti-onkojenik genleri aşağı doğru düzenlediğini ve tümör büyümesindeki rollerini koruduklarını doğrulayabiliriz.
Toxoplasma RH ile enfekte BV2'den türetilmiş eksozomlar, Toxoplasma RH ile enfekte olmuş BV2'den türetilmiş eksozomlar tarafından U87 glioma hücrelerinde antitümör genlerin baskılanmasını indükler.(A) PBS eksozomlarına kıyasla T. gondii RH ile enfekte BV2'den türetilen eksozomlarda FoxO1, PTEN ve PDCD4 ekspresyonunun gerçek zamanlı PCR'si.β-aktin mRNA, kontrol olarak kullanıldı.(B) FoxO1 ifadesi, Western lekeleme ile belirlendi ve densitometri verileri, ImageJ programı kullanılarak istatistiksel olarak değerlendirildi. *P < 0.05, Student t testi ile elde edilmiştir. *P < 0.05, Student t testi ile elde edilmiştir. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0.05, Student t testi kullanılarak elde edilmiştir. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05, Student t testi kullanılarak elde edilmiştir.
Eksozomlardaki miP-21'in tümörle ilişkili gen regülasyonu üzerindeki etkisini anlamak için, U87 hücreleri, Lipofectamine 2000 kullanılarak bir miP-21 inhibitörü ile transfekte edildi ve hücreler, transfeksiyondan 24 saat sonra toplandı.miR-21 inhibitörleri ile transfekte edilmiş hücrelerde FoxO1 ve p27 ekspresyon seviyeleri, qRT-PCR kullanılarak BV2'den türetilmiş eksozomlarla tedavi edilen hücrelerle karşılaştırıldı (Şekil 6A,B).miR-21 inhibitörünün U87 hücrelerine transfeksiyonu, FoxO1 ve p27 ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 6).
RH ile enfekte olmuş eksozomal BV2'den türetilen miP-21, U87 glioma hücrelerinde FoxO1/p27 ekspresyonunu değiştirmiştir.U87 hücreleri, Lipofectamine 2000 kullanılarak miP-21 inhibitörü ile transfekte edildi ve hücreler, transfeksiyondan 24 saat sonra toplandı.miR-21 inhibitörleri ile transfekte edilmiş hücrelerdeki FoxO1 ve p27 ekspresyon seviyeleri, qRT-PCR (A, B) kullanılarak BV2'den türetilmiş eksozomlarla tedavi edilen hücrelerdeki seviyelerle karşılaştırıldı.
Toksoplazma paraziti, konakçının bağışıklık tepkisinden kaçmak için bir doku kistine dönüşür.Konakçının ömrü boyunca beyin, kalp ve iskelet kası dahil olmak üzere çeşitli dokuları parazitlerler ve konağın bağışıklık tepkisini modüle ederler.Ek olarak, hücre döngüsünü ve konakçı hücrelerin apoptozunu düzenleyerek çoğalmalarını teşvik edebilirler14,24.Toxoplasma gondii ağırlıklı olarak konak dendritik hücreleri, nötrofilleri ve beyin mikrogliası dahil monosit/makrofaj soyunu enfekte eder.Toxoplasma gondii, M2 fenotipinin makrofajlarının farklılaşmasını indükler, patojen enfeksiyonundan sonra yara iyileşmesini etkiler ve ayrıca hipervaskülarizasyon ve granülomatöz fibroz ile ilişkilidir.Toksoplazma enfeksiyonunun bu davranışsal patogenezi, tümör gelişimi ile ilişkili belirteçlerle ilişkili olabilir.Toxoplasma tarafından düzenlenen düşmanca ortam, karşılık gelen kanser öncüsüne benzeyebilir.Bu nedenle, Toksoplazma enfeksiyonunun beyin tümörlerinin gelişimine katkıda bulunması gerektiği varsayılabilir.Aslında, çeşitli beyin tümörlerine sahip hastaların serumunda yüksek Toksoplazma enfeksiyonu oranları bildirilmiştir.Ek olarak, Toxoplasma gondii başka bir kanserojen efektör olabilir ve diğer enfeksiyöz kanserojenlerin beyin tümörleri geliştirmesine yardımcı olmak için sinerjistik olarak hareket edebilir.Bu bağlamda, P. falciparum ve Epstein-Barr virüsünün sinerjik olarak Burkitt lenfoma oluşumuna katkıda bulunduğunu belirtmekte fayda var.
Eksozomların kanser araştırmaları alanında düzenleyiciler olarak rolü kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır.Bununla birlikte, parazitler ve enfekte konakçılar arasındaki eksozomların rolü tam olarak anlaşılmamıştır.Şimdiye kadar, salgılanan proteinler de dahil olmak üzere çeşitli düzenleyiciler, protozoan parazitlerin konak saldırısına direndiği ve enfeksiyonu sürdürdüğü biyolojik süreçleri açıkladı.Son zamanlarda, protozoan ile ilişkili mikro-parçacıkların ve bunların mikroRNA'larının, hayatta kalmaları için uygun bir ortam yaratmak üzere konakçı hücrelerle etkileşime girdiğine dair büyüyen bir kavram olmuştur.Bu nedenle, değiştirilmiş ekzozomal miRNA'lar ile glioma hücre proliferasyonu arasındaki ilişkiyi keşfetmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.MikroRNA değişikliği (küme genleri miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 ve miR-17-92), toksoplazma ile enfekte olmuş insan makrofajlarında STAT3 promotörüne bağlanır, düzenlenir ve anti indükler -Toxoplasma gondii enfeksiyonuna yanıt olarak apoptoz 29.Toksoplazma enfeksiyonu, birkaç hiperproliferatif hastalık 30 ile ilişkili olan miR-17-5p ve miR-106b-5p'nin ifadesini arttırır.Bu veriler, Toksoplazma enfeksiyonu tarafından düzenlenen konakçı miRNA'ların, konak biyolojik davranışında parazitin hayatta kalması ve patogenezi için önemli moleküller olduğunu göstermektedir.
Değiştirilmiş miRNA'lar, gliomalar dahil olmak üzere habis hücrelerin başlatılması ve ilerlemesi sırasında çeşitli davranış türlerini etkileyebilir: büyüme sinyallerinin kendi kendine yeterliliği, büyümeyi engelleyen sinyallere duyarsızlık, apoptoz kaçırma, sınırsız replikasyon potansiyeli, anjiyogenez, istila ve metastaz ve iltihaplanma.Gliomada, çeşitli ekspresyon profilleme çalışmalarında değiştirilmiş miRNA'lar tanımlanmıştır.
Bu çalışmada, toksoplazma ile enfekte olmuş konakçı hücrelerde yüksek düzeyde miRNA-21 ekspresyonu olduğunu doğruladık.miR-21, gliomalar dahil olmak üzere katı tümörlerde en sık aşırı eksprese edilen mikroRNA'lardan biri olarak tanımlanmıştır33 ve ekspresyonu, glioma derecesi ile ilişkilidir.Biriken kanıtlar, miR-21'in glioma büyümesinde anti-apoptotik bir faktör olarak işlev gören ve insan beyni malignitelerinin dokularında ve plazmasında yüksek oranda aşırı eksprese edilen yeni bir onkogen olduğunu göstermektedir.İlginç bir şekilde, glioma hücreleri ve dokularında miR-21 inaktivasyonu, kaspaz bağımlı apoptoz nedeniyle hücre proliferasyonunun inhibisyonunu tetikler.miR-21 ile tahmin edilen hedeflerin biyoinformatik analizi, programlanmış hücre ölümü 4 (PDCD4), tropomiyosin (TPM1), PTEN ve miR-2121 bağlama bölgesi ile çatal uçlu kutu O1 (FoxO1) dahil olmak üzere apoptoz yollarıyla ilişkili çoklu tümör baskılayıcı genleri ortaya çıkardı..22.38.
Transkripsiyon faktörlerinden (FoxO) biri olan FoxO1, çeşitli insan kanseri türlerinin gelişiminde yer alır ve p21, p27, Bim ve FasL40 gibi tümör baskılayıcı genlerin ekspresyonunu düzenleyebilir.FoxO1, hücre büyümesini baskılamak için p27 gibi hücre döngüsü inhibitörlerini bağlayabilir ve etkinleştirebilir.Ayrıca FoxO1, PI3K/Akt sinyalinin kilit bir efektörüdür ve p2742 transkripsiyonunun aktivasyonu yoluyla hücre döngüsü ilerlemesi ve hücre farklılaşması gibi birçok biyolojik süreci düzenler.
Sonuç olarak, Toksoplazma ile enfekte olmuş mikrogliadan türetilen eksozomal miR-21'in, glioma hücrelerinin büyüme düzenleyicisi olarak önemli bir rol oynayabileceğine inanıyoruz (Şekil 7).Bununla birlikte, ekzozomal miR-21, değiştirilmiş Toksoplazma enfeksiyonu ve glioma büyümesi arasında doğrudan bir bağlantı bulmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.Bu sonuçların, Toksoplazma enfeksiyonu ile glioma insidansı arasındaki ilişkiyi incelemek için bir başlangıç ​​noktası sağlaması beklenmektedir.
Bu çalışmada glioma (beyin) karsinojenezi mekanizmasının şematik bir diyagramı önerilmiştir.Yazar, PowerPoint 2019'da (Microsoft, Redmond, WA) çizim yapıyor.
Hayvanların kullanımı da dahil olmak üzere bu çalışmadaki tüm deney protokolleri, Seul Ulusal Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanıcı Komitesi Standart Etik Yönergelerine uygundu ve Seul Ulusal Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB numarası SNU-) tarafından onaylandı. 150715).-2).Tüm deneysel prosedürler, ARRIVE tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
BV2 fare mikroglia ve U87 insan glioma hücreleri, sırasıyla her biri %10 fetal sığır serumu, 4 mM l- içeren Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) ve Roswell Park Memorial Institute's Medium'da (RPMI; Welgene) kültürlendi. glutamin, 0.2 mM penisilin ve 0.05 mM streptomisin.Hücreler, 37°C'de %5 CO2 içeren bir inkübatörde kültürlendi.Başka bir glioma hücre dizisi olan U118, U87 hücreleri ile karşılaştırma için kullanıldı.
T. gondii ile enfekte RH ve ME49 suşlarından eksozomları izole etmek için, 3-4 gün önce enjekte edilen 6 haftalık BALB/c farelerinin karın boşluğundan T. gondii takizoitleri (RH suşu) toplandı.Takizoitler, üç kez PBS ile yıkandı ve %40 Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD)43 içinde santrifüjleme yoluyla saflaştırıldı.ME49 suşunun takizoitlerini elde etmek için, BALB/c farelerine intraperitoneal olarak 20 doku kisti enjekte edildi ve enfeksiyondan sonraki 6-8. günde karın boşluğu yıkanarak kistlerdeki takizoit dönüşümü toplandı (PI).PBS ile enfekte fareler.ME49 takizoitleri, 100 μg/ml penisilin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, ABD), 100 μg/ml streptomisin (Gibco/BRL) ve %5 fetal sığır serumu (Lonza, Walkersville, MD) ile desteklenmiş hücrelerde büyütüldü. .., ABD) 37 °C ve %5 karbondioksitte.Vero hücrelerinde kültivasyondan sonra ME49 takizoitleri, birikintileri ve hücreleri çıkarmak için iki kez 25 gauge iğneden ve ardından 5 um'lik bir filtreden geçirildi.Yıkandıktan sonra takizoitler, PBS44 içinde yeniden süspanse edildi.Toxoplasma gondii suşu ME49'un doku kistleri, enfekte olmuş C57BL/6 farelerinin (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Kore) beyninden izole edilen kistlerin intraperitoneal enjeksiyonu ile muhafaza edildi.ME49 ile enfekte olmuş farelerin beyinleri, 3 aylık PI'den sonra toplandı ve kistleri izole etmek için mikroskop altında kıyıldı.Enfekte fareler, Seul Ulusal Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde özel patojen içermeyen koşullar (SPF) altında tutuldu.
Toplam RNA, elüsyon adımı için inkübasyon süresi de dahil olmak üzere üreticinin talimatlarına göre miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak BV2'den türetilen eksozomlardan, BV2 hücrelerinden ve dokulardan ekstre edildi.RNA konsantrasyonu, bir NanoDrop 2000 spektrofotometre üzerinde belirlendi.RNA mikrodizilerinin kalitesi, bir Agilent 2100 biyoanalizör (Agilent Technologies, Amstelveen, Hollanda) kullanılarak değerlendirildi.
%10 eksozom-zayıf FBS'li DMEM, 16 saat boyunca 4°C'de 100,000 g'de ultrasantrifüjleme yoluyla hazırlandı ve 0.22 um'lik bir filtreden (Nalgene, Rochester, NY, ABD) süzüldü.BV2 hücreleri, 5 x 105, 37°C'de ve %5 C02'de %10 eksozom tüketen FBS ve %1 antibiyotik içeren DMEM içinde kültürlendi.24 saatlik inkübasyonun ardından, hücrelere RH veya ME49 (MOI = 10) takizoitleri ilave edildi ve istilacı olmayan parazitler bir saat içinde çıkarıldı ve DMEM ile yeniden dolduruldu.BV2 hücrelerinden eksozomlar, en yaygın kullanılan yöntem olan modifiye diferansiyel santrifüjleme ile izole edildi.RNA veya protein analizi için 300 ul PBS içinde eksozom topağı yeniden süspanse edin.İzole edilmiş eksozomların konsantrasyonu, bir BCA protein tahlil kiti (Pierce, Rockford, IL, ABD) ve bir NanoDrop 2000 spektrofotometre kullanılarak belirlendi.
BV2 hücrelerinden veya BV2'den türetilen eksozomlardan çökeltiler, PRO-PREP™ protein ekstraksiyon solüsyonunda (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Kore) parçalandı ve proteinler, Coomassie parlak mavi lekeli %10 SDS poliakrilamid jellerine yüklendi.Ek olarak, proteinler 2 saat boyunca PVDF membranlarına aktarıldı.Western blotlar, bir ekzozomal işaretleyici olarak Alix antikoru (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ABD) kullanılarak doğrulandı.İkincil antikor olarak HRP-konjuge keçi anti-fare IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, ABD) ve bir LAS-1000 plus lüminesan görüntü analiz cihazı (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japonya) kullanıldı..Eksozomların büyüklüğünü ve morfolojisini incelemek için transmisyon elektron mikroskobu yapıldı.BV2 hücrelerinden (6.40 ug/ul) izole edilen eksozomlar, karbon kaplı ağlarda hazırlandı ve 1 dakika boyunca %2 uranil asetat ile negatif olarak boyandı.Hazırlanan numuneler, ES1000W Erlangshen CCD kamera (Gatan, Pleasanton, CA, ABD) ile donatılmış bir JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japonya) kullanılarak 80 kV hızlandırıcı voltajda gözlendi.
BV2'den türetilen eksozomlar, oda sıcaklığında 15 dakika PKH26 Kırmızı Floresan Bağlayıcı Kiti (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) kullanılarak boyandı.Negatif kontrol olarak PKH26 etiketli eksozomlar (kırmızı) içeren veya eksozom içermeyen 2x105 U87 hücreleri, %5 CO2 inkübatöründe 24 saat 37°C'de inkübe edildi.U87 hücre çekirdekleri, DAPI (mavi) ile boyandı, U87 hücreleri, 4°C'de 15 dakika süreyle %4 paraformaldehit içinde sabitlendi ve ardından bir Leica TCS SP8 STED CW konfokal mikroskop sisteminde (Leica Microsystems, Mannheim, Almanya) analiz edildi.gözlemlenebilir
cDNA, Mir-X siRNA birinci sarmal sentezi ve SYBR qRT-PCR kiti (Takara Bio Inc., Shiga, Japonya) kullanılarak siRNA'dan sentezlendi.Gerçek zamanlı kantitatif PCR, SYBR Premix ile karıştırılmış primerler ve şablonlar kullanılarak iQ5 gerçek zamanlı PCR tespit sistemi (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi.DNA, 95°C'de 15 s için 40 denatürasyon döngüsü ve 60 s için 60°C'de tavlama için amplifiye edildi.Her PCR reaksiyonundan elde edilen veriler, iQ™5 optik sistem yazılımının (Bio-Rad) veri analiz modülü kullanılarak analiz edildi.Seçilen hedef genler ve β-aktin/siRNA (ve U6) arasındaki gen ifadesindeki nispi değişiklikler, standart eğri yöntemi kullanılarak hesaplandı.Kullanılan primer dizileri Tablo 1'de gösterilmiştir.
3 x 104 U87 glioma hücresi, 96 oyuklu plakalara ekildi ve kontroller olarak 12, 18 ve 36 saatte BV2'den (50 ug/mL) türetilen Toksoplazma ile enfekte eksozomlar veya BV2'den (50 ug/mL) türetilen puls olmayan eksozomlarla karıştırıldı. .Hücre çoğalma hızı, Hücre Sayma Kiti-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonya) (Ek Şekiller S1-S3) 46 kullanılarak belirlendi.
5 haftalık dişi BALB/c çıplak fareler, Orient Bio'dan (Seongnam-si, Güney Kore) satın alındı ​​ve oda sıcaklığında (22±2°C) ve nemde (45±15°C) steril kafeslerde ayrı ayrı tutuldu.%) oda sıcaklığında (22±2°C) ve nemde (%45±15).SPF (Seul Ulusal Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Merkezi) altında 12 saatlik bir ışık döngüsü ve 12 saatlik bir karanlık döngüsü gerçekleştirildi.Fareler rastgele olarak her biri 5 fareden oluşan üç gruba ayrıldı ve tüm gruplara deri altından 1 x 107 U87 glioma hücresi ve büyüme faktörü azaltılmış BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, ABD) içeren 400 ml PBS enjekte edildi.Tümör enjeksiyonundan altı gün sonra, tümör bölgesine BV2 hücrelerinden (Toksoplazma enfeksiyonu olan/olmayan) türetilen 200 mg eksozom enjekte edildi.Tümör enfeksiyonundan yirmi iki gün sonra, her gruptaki farelerin tümör boyutu haftada üç kez bir kumpasla ölçüldü ve tümör hacmi şu formülle hesaplandı: 0.5×(genişlik)×2×uzunluk.
3100 insan, fare ve sıçan miRNA yakalama probu arasından 1119 iyi karakterize edilmiş fareyi kapsayan miRCURYTM LNA miRNA dizisi, 7. nesil, mmu ve rno dizilerine (EXIQON, Vedbaek, Danimarka) sahip mikroRNA ekspresyon analizi.Bu prosedür sırasında, 250 ila 1000 ng toplam RNA, dana bağırsağı alkalin fosfataz ile işlenerek ve ardından Hy3 yeşil flüoresan boya ile etiketlenerek 5'-fosfattan çıkarıldı.Etiketli numuneler daha sonra bir hibridizasyon odası kiti (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD) ve bir hibridizasyon slayt kiti (Agilent Technologies) kullanılarak mikrodizi slaytları yüklenerek hibritlendi.Hibridizasyon 56°C'de 16 saat gerçekleştirildi, ardından mikrodiziler üreticinin tavsiyelerine göre yıkandı.İşlenen mikrodizi slaytları daha sonra bir Agilent G2565CA mikrodizi tarayıcı sistemi (Agilent Technologies) kullanılarak tarandı.Taranan görüntüler, Agilent Feature Extraction yazılımı sürüm 10.7.3.1 (Agilent Technologies) kullanılarak içe aktarıldı ve her görüntünün floresan yoğunluğu, değiştirilmiş Exiqon protokolünün karşılık gelen GAL dosyası kullanılarak ölçüldü.Mevcut çalışma için mikrodizi verileri, GPL32397 erişim numarası altında GEO veri tabanında saklanmaktadır.
Toksoplazma ile enfekte olmuş RH veya ME49 suşlarının mikrogliasındaki olgun ekzozomal miRNA'ların ekspresyon profilleri, çeşitli ağ araçları kullanılarak analiz edildi.Tümör gelişimi ile ilişkili miRNA'lar, miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) kullanılarak tanımlandı ve 8.0'dan büyük normalleştirilmiş sinyal yoğunluğu (log2) ile filtrelendi.miRNA'lar arasında, diferansiyel olarak eksprese edilen miRNA'ların, T. gondii ile enfekte olmuş RH veya ME49 suşları tarafından değiştirilen miRNA'ların filtre analizi ile 1,5 kattan fazla değiştirildiği bulundu.
Hücreler, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak opti-MEM'de (Gibco, Carlsbad, CA, ABD) altı oyuklu plakalara (3 x 105 hücre/kuyu) ekildi.Transfekte edilmiş hücreler, 6 saat süreyle kültürlendi ve daha sonra ortam, taze tam ortam ile değiştirildi.Hücreler, transfeksiyondan 24 saat sonra toplandı.
İstatistiksel analiz esas olarak Excel yazılımı (Microsoft, Washington, DC, ABD) ile Student's t-testi kullanılarak yapıldı.Deneysel hayvan analizi için, Prism 3.0 yazılımı (GraphPad Software, La Jolla, CA, ABD) kullanılarak iki yönlü bir ANOVA gerçekleştirildi. P-değerleri < 0.05, istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. P değerleri <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P<0,05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P < 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P<0,05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Bu çalışmada kullanılan tüm deney protokolleri, Seul Ulusal Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK numarası SNU-150715-2) tarafından onaylanmıştır.
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. ve ark.2018'de tahmini küresel kanser insidansı ve ölüm oranı: GLOBOCAN kaynakları ve yöntemleri.Tercüme.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Beyin tümörlerinin risk faktörlerine ve terapötik müdahalelerine dair bir içgörü. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Beyin tümörlerinin risk faktörlerine ve terapötik müdahalelerine dair bir içgörü.Rashid, S., Rehman, K. ve Akash, MS Beyin tümörleri ve majör terapötik müdahaleler için risk faktörlerinin gözden geçirilmesi. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Beyin tümörü risk faktörlerinin ve terapötik müdahalelerin derinlemesine anlaşılması.Rashid, S., Rehman, K. ve Akash, MS Beyin tümörleri ve majör terapötik müdahaleler için risk faktörlerinin gözden geçirilmesi.Biyomedikal Bilim.Eczacı.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. İnsan orodindirim ve kadın genital sistem kanserlerinde bakteriyel-viral etkileşimler: Epidemiyolojik ve laboratuvar kanıtlarının bir özeti. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. İnsan orodindirim ve kadın genital sistem kanserlerinde bakteriyel-viral etkileşimler: Epidemiyolojik ve laboratuvar kanıtlarının bir özeti.Kato I., Zhang J. ve Sun J. İnsan gastrointestinal sistemi ve kadın genital sistemi kanserinde bakteriyel-viral etkileşimler: epidemiyolojik ve laboratuvar verilerinin bir özeti. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. İnsan ağız boşluğu sindiriminde ve dişi üreme sisteminde bakteri-viral etkileşim: popüler hastalık biliminin özeti ve laboratuvar kanıtları.Kato I., Zhang J. ve Sun J. İnsan gastrointestinal kanserinde ve kadın genital kanserinde bakteriyel-viral etkileşimler: epidemiyolojik ve laboratuvar verilerinin bir özeti.Yengeç 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Enfeksiyondan kansere: DNA tümör virüsleri konak hücre merkezi karbon ve lipid metabolizmasını nasıl değiştirir? Magon, KL & Parish, JL Enfeksiyondan kansere: DNA tümör virüsleri konak hücre merkezi karbon ve lipid metabolizmasını nasıl değiştirir?Mahon, KL ve Parish, JL Yangın enfeksiyonundan kansere: DNA tabanlı tümör virüslerinin konakçı hücre merkezi karbon ve lipid metabolizmasını nasıl değiştirdiği. Magon, KL & Parish, JL Magon, KL & Parish, JL Enfeksiyondan kansere: DNA tümör virüsleri, konakçı hücre merkezi karbon ve lipid metabolizmasını nasıl değiştirir.Mahon, KL ve Parish, JL Fires enfeksiyondan kansere: DNA tümör virüsleri, konakçı hücrelerde merkezi karbon ve lipid metabolizmasını nasıl değiştirir?Biyoloji aç.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM ve ark.Şistozomların ve karaciğer kelebeklerinin ve helmint ilişkili kanserin katekol östrojenleri.ön.içerisi sıcak.5, 444 (2014).