Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullanmakta olduğunuz tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan yapacağız.
Pulmoner kistik fibrozisin tedavisi için gen vektörleri, periferik akciğer transdüksiyonunun terapötik bir etkisi olmadığından, iletken hava yollarını hedef almalıdır.Viral transdüksiyonun etkinliği, taşıyıcının kalış süresi ile doğrudan ilişkilidir.Bununla birlikte, gen taşıyıcıları gibi dağıtım sıvıları, inhalasyon sırasında doğal olarak alveollere yayılır ve herhangi bir şekle sahip terapötik partiküller, mukosiliyer taşıma ile hızla uzaklaştırılır.Gen taşıyıcılarının solunum yollarında kalış sürelerinin uzatılması önemlidir ancak başarılması zordur.Solunum yolunun yüzeyine yönlendirilebilen taşıyıcı konjuge manyetik parçacıklar, bölgesel hedeflemeyi iyileştirebilir.İn vivo görüntüleme ile ilgili problemler nedeniyle, uygulanan bir manyetik alan varlığında hava yolu yüzeyindeki bu tür küçük manyetik parçacıkların davranışı tam olarak anlaşılamamıştır.Bu çalışmanın amacı, in vivo olarak tek ve toplu parçacıkların dinamiklerini ve davranış modellerini incelemek için anestezi uygulanmış farelerin trakeasındaki bir dizi manyetik parçacığın hareketini in vivo görselleştirmek için senkrotron görüntülemeyi kullanmaktı.Daha sonra, bir manyetik alan varlığında lentiviral manyetik parçacıkların verilmesinin, sıçan trakeasındaki transdüksiyonun etkinliğini artırıp artırmayacağını da değerlendirdik.Synchrotron X-ray görüntüleme, manyetik parçacıkların sabit ve hareketli manyetik alanlardaki davranışını in vitro ve in vivo olarak gösterir.Parçacıklar, mıknatıslar kullanılarak canlı hava yollarının yüzeyinde kolayca sürüklenemez, ancak taşıma sırasında tortular, manyetik alanın en güçlü olduğu görüş alanında yoğunlaşır.Bir manyetik alan varlığında lentiviral manyetik parçacıklar iletildiğinde transdüksiyon verimliliği de altı kat arttı.Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar, lentiviral manyetik parçacıkların ve manyetik alanların, in vivo olarak iletken hava yollarında gen vektörü hedefleme ve transdüksiyon seviyelerini iyileştirmek için değerli yaklaşımlar olabileceğini düşündürmektedir.
Kistik fibroz (KF), CF transmembran iletkenlik düzenleyici (CFTR) adı verilen tek bir gendeki varyasyonlardan kaynaklanır.CFTR proteini, kistik fibrozisin patogenezinde ana bölge olan hava yolları da dahil olmak üzere vücuttaki birçok epitel hücresinde bulunan bir iyon kanalıdır.CFTR'deki kusurlar anormal su taşınımına, hava yolu yüzeyinin dehidrasyonuna ve hava yolu yüzey sıvı tabakası (ASL) derinliğinin azalmasına yol açar.Ayrıca mukosiliyer taşıma (MCT) sisteminin solunum yollarını solunan partiküller ve patojenlerden temizleme yeteneğini de bozar.Amacımız, CFTR geninin doğru kopyasını iletmek ve ASL, MCT ve akciğer sağlığını iyileştirmek için bir lentiviral (LV) gen tedavisi geliştirmek ve bu parametreleri in vivo1 ölçebilen yeni teknolojiler geliştirmeye devam etmektir.
LV vektörleri, terapötik geni hava yolu bazal hücrelerine (hava yolu kök hücreleri) kalıcı olarak entegre edebildikleri için, kistik fibroz gen terapisi için önde gelen adaylardan biridir.Bu önemlidir, çünkü kistik fibroz ile ilişkili fonksiyonel gen düzeltmeli hava yolu yüzey hücrelerine farklılaşarak normal hidrasyonu ve mukus klirensini geri yükleyebilirler ve bu da yaşam boyu fayda sağlar.LV vektörleri, KF'de akciğer tutulumunun başladığı yer burası olduğundan, iletken hava yollarına yönlendirilmelidir.Vektörün akciğerin daha derinlerine iletilmesi alveoler transdüksiyonla sonuçlanabilir, ancak bunun kistik fibrozda terapötik bir etkisi yoktur.Bununla birlikte, gen taşıyıcıları gibi sıvılar, doğumdan sonra solunduğunda doğal olarak alveollere geçer3,4 ve terapötik parçacıklar, MCT'ler tarafından hızla ağız boşluğuna atılır.Sol ventrikül transdüksiyonunun verimliliği, hücresel alıma izin vermek için vektörün hedef hücrelere yakın kaldığı sürenin uzunluğuyla doğrudan ilişkilidir - tipik bölgesel hava akımının yanı sıra mukus ve MCT partiküllerinin koordineli alımıyla kolayca kısaltılan "kalma süresi" 5.Kistik fibroz için, hava yollarında LV kalma süresini uzatma yeteneği, bu alanda yüksek transdüksiyon seviyeleri elde etmek için önemlidir, ancak şimdiye kadar zor olmuştur.
Bu engelin üstesinden gelmek için, LV manyetik parçacıklarının (MP'ler) iki tamamlayıcı şekilde yardımcı olabileceğini öneriyoruz.İlk olarak, hedeflemeyi iyileştirmek ve gen taşıyıcı parçacıkların hava yolunun doğru bölgesinde olmasına yardımcı olmak için bir mıknatıs tarafından hava yolu yüzeyine yönlendirilebilirler;ve ASL) hücre katmanı 6'ya hareket eder. MP'ler, antikorlara, kemoterapi ilaçlarına veya hücre zarlarına bağlanan veya ilgili hücre yüzeyi reseptörlerine bağlanan ve tümör bölgelerinde biriken diğer küçük moleküllere bağlandıklarında hedeflenen ilaç verme araçları olarak yaygın şekilde kullanılır. statik elektriğin varlığı.Kanser tedavisi için manyetik alanlar 7. Diğer "hipertermik" yöntemler, salınan manyetik alanlara maruz kaldıklarında MP'leri ısıtarak tümör hücrelerini öldürmeyi amaçlar.DNA'nın hücrelere transferini arttırmak için bir transfeksiyon ajanı olarak bir manyetik alanın kullanıldığı manyetik transfeksiyon ilkesi, transdüksiyonu zor hücre hatları için bir dizi viral olmayan ve viral gen vektörü kullanılarak in vitro olarak yaygın olarak kullanılır. ..LV MP'nin statik bir manyetik alan varlığında insan bronşiyal epitelinin bir hücre hattına in vitro olarak verilmesiyle LV manyetotransfeksiyonunun etkinliği belirlendi ve tek başına LV vektörüne kıyasla transdüksiyon verimliliğini 186 kat artırdı.LV MT ayrıca kistik fibrozun in vitro bir modeline uygulanmıştır; burada manyetik transfeksiyon, kistik fibroz balgamı varlığında hava-sıvı arayüz kültürlerinde LV transdüksiyonunu 20 kat arttırmıştır10.Bununla birlikte, in vivo organ manyetotransfeksiyonu nispeten az ilgi görmüştür ve yalnızca birkaç hayvan çalışmasında11,12,13,14,15, özellikle akciğerlerde16,17 değerlendirilmiştir.Bununla birlikte, kistik fibrozda akciğer tedavisinde manyetik transfeksiyonun olasılıkları açıktır.Tan ve ark.(2020), "manyetik nanopartiküllerin etkili pulmoner iletimine ilişkin bir doğrulama çalışmasının, kistik fibrozlu hastalarda klinik sonuçları iyileştirmek için gelecekteki CFTR inhalasyon stratejilerinin yolunu açacağını"6 belirtmiştir.
Uygulanan bir manyetik alan varlığında solunum yolunun yüzeyindeki küçük manyetik parçacıkların davranışını görselleştirmek ve incelemek zordur ve bu nedenle tam olarak anlaşılamamıştır.Diğer çalışmalarda, gaz kanalı yüzeyi hidrasyonunu doğrudan ölçmek için ASL18 derinliği ve MCT19 davranışı20'deki invazif olmayan görüntüleme ve dakika in vivo değişikliklerin miktarının belirlenmesi için bir Senkrotron Yayılımına Dayalı Faz Kontrast X-Ray Görüntüleme (PB-PCXI) yöntemi geliştirdik. ve tedavi etkinliğinin erken göstergesi olarak kullanılır.Ek olarak, MCT puanlama yöntemimiz, PB-PCXI21 ile görülebilen MCT işaretleri olarak alümina veya yüksek kırılma indeksli camdan oluşan 10–35 µm çapında parçacıklar kullanır.Her iki yöntem de MP'ler de dahil olmak üzere bir dizi parçacık türünün görüntülenmesi için uygundur.
Yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük nedeniyle, PB-PCXI tabanlı ASL ve MCT analizlerimiz, MP gen teslim yöntemlerini anlamamıza ve optimize etmemize yardımcı olmak için in vivo olarak tek ve toplu parçacıkların dinamiklerini ve davranış modellerini incelemek için çok uygundur.Burada kullandığımız yaklaşım, gözlemlenen heterojen gen ekspresyon modellerimizi açıklamaya yardımcı olmak için farelerin nazal ve pulmoner hava yollarına bir doz sahte vektör verilmesinin ardından sıvı hareketini görselleştirdiğimiz SPring-8 BL20B2 ışın hattını kullanan çalışmalarımıza dayanmaktadır. bizim genimizde3.4 taşıyıcı dozlu hayvan çalışmaları.
Bu çalışmanın amacı, canlı farelerin trakeasındaki bir dizi MP'nin in vivo hareketlerini görselleştirmek için PB-PCXI senkrotronunu kullanmaktı.Bu PB-PCXI görüntüleme çalışmaları, MP serisini, manyetik alan gücünü ve MP hareketi üzerindeki etkilerini belirlemek için konumu test etmek üzere tasarlanmıştır.Harici bir manyetik alanın iletilen MF'nin hedef bölgede kalmasına veya hareket etmesine yardımcı olacağını varsaydık.Bu çalışmalar aynı zamanda birikmeden sonra trakeada kalan partikül miktarını en üst düzeye çıkaran mıknatıs konfigürasyonlarını belirlememizi sağladı.İkinci bir dizi çalışmada, LV-MP'lerin hava yolu hedeflemesi bağlamında verilmesinin sonuçlanacağı varsayımıyla, LV-MP'lerin sıçan hava yollarına in vivo verilmesinden kaynaklanan transdüksiyon modelini göstermek için bu optimal konfigürasyonu kullanmayı amaçladık. artan LV transdüksiyon verimliliğinde..
Tüm hayvan çalışmaları, Adelaide Üniversitesi (M-2019-060 ve M-2020-022) ve SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee tarafından onaylanan protokollere uygun olarak yapılmıştır.Deneyler, ARRIVE'ın tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
Tüm röntgen görüntüleri, daha önce21,22açıklanana benzer bir kurulum kullanılarak Japonya'daki SPring-8 senkrotrondaki BL20XU ışın hattında alınmıştır.Kısaca, deney kutusu, senkrotron depolama halkasından 245 m uzağa yerleştirildi.Parçacık görüntüleme çalışmaları için 0,6 m'lik bir numune-dedektör mesafesi ve faz kontrast etkileri oluşturmak için in vivo görüntüleme çalışmaları için 0,3 m kullanılır.25 keV enerjiye sahip tek renkli bir ışın kullanıldı.Görüntüler, bir sCMOS dedektörüne bağlı yüksek çözünürlüklü bir X-ışını dönüştürücü (SPring-8 BM3) kullanılarak elde edildi.Dönüştürücü, X-ışınlarını 10 µm kalınlığında bir sintilatör (Gd3Al2Ga3O12) kullanarak görünür ışığa dönüştürür ve daha sonra x10 (NA 0.3) mikroskop hedefi kullanılarak sCMOS sensörüne yönlendirilir.sCMOS detektörü, dizi boyutu 2048 × 2048 piksel ve ham piksel boyutu 6,5 × 6,5 µm olan bir Orca-Flash4.0'dı (Hamamatsu Photonics, Japonya).Bu ayar, 0,51 µm'lik etkili bir izotropik piksel boyutu ve yaklaşık 1,1 mm × 1,1 mm'lik bir görüş alanı sağlar.100 ms'lik maruz kalma süresi, solunum yollarının içindeki ve dışındaki manyetik parçacıkların sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak ve nefes almanın neden olduğu hareket artefaktlarını en aza indirmek için seçildi.In vivo çalışmalar için, X-ışını ışınını pozlamalar arasında bloke ederek radyasyon dozunu sınırlamak için X-ışını yoluna hızlı bir X-ışını deklanşörü yerleştirildi.
BL20XU görüntüleme odası Biyogüvenlik Düzey 2 sertifikalı olmadığı için hiçbir SPring-8 PB-PCXI görüntüleme çalışmasında LV ortamı kullanılmadı.Bunun yerine, manyetik alanların cam kılcal damarlardaki MP'lerin hareketini nasıl etkilediğini anlamak için, bir dizi boyut, malzeme, demir konsantrasyonu ve uygulamayı kapsayan iki ticari satıcıdan iyi karakterize edilmiş bir MP serisi seçtik. yaşayan hava yolları.yüzey.MP'nin boyutu 0,25 ila 18 µm arasında değişir ve çeşitli malzemelerden yapılır (bkz. Tablo 1), ancak MP'deki manyetik parçacıkların boyutu da dahil olmak üzere her numunenin bileşimi bilinmemektedir.Kapsamlı MCT çalışmalarımıza 19, 20, 21, 23, 24 dayanarak, örneğin, MP hareketinin gelişmiş görünürlüğünü görmek için ardışık kareleri çıkararak, trakeal hava yolu yüzeyinde 5 µm'ye kadar inen MP'lerin görülebileceğini umuyoruz.0,25 µm'lik tek bir MP, görüntüleme cihazının çözünürlüğünden daha küçüktür, ancak PB-PCXI'nin bunların hacimsel kontrastını ve biriktikten sonra üzerinde biriktikleri yüzey sıvısının hareketini algılaması beklenir.
Tablodaki her MP için örnekler.1, iç çapı 0,63 mm olan 20 ul cam kılcal damarlarda (Drummond Microcaps, PA, ABD) hazırlandı.Corpuscular partiküller suda bulunurken, CombiMag partikülleri üreticinin tescilli sıvısında mevcuttur.Her bir tüp sıvı (yaklaşık 11 µl) ile yarıya kadar doldurulur ve numune tutucuya yerleştirilir (bkz. Şekil 1).Cam kılcal damarlar sırasıyla görüntüleme odasında sahneye yatay olarak yerleştirildi ve sıvının kenarlarına yerleştirildi.Nadir toprak, neodimyum, demir ve bordan (NdFeB) (N35, kat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Avustralya) yapılmış 19 mm çapında (28 mm uzunluğunda) nikel kabuklu bir mıknatıs, 1.17 T kalıntı ile bir mıknatısa takıldı. Oluşturma sırasında konumunuzu uzaktan değiştirmek için ayrı transfer tablosu.Röntgen görüntüleme, mıknatıs numunenin yaklaşık 30 mm yukarısına yerleştirildiğinde başlar ve görüntüler saniyede 4 kare hızında alınır.Görüntüleme sırasında, mıknatıs cam kılcal boruya yaklaştırıldı (yaklaşık 1 mm mesafede) ve ardından alan kuvveti ve konumunun etkisini değerlendirmek için boru boyunca hareket ettirildi.
Xy numunesinin translasyonu aşamasında cam kılcal damarlarda MP numuneleri içeren bir in vitro görüntüleme kurulumu.X-ışını ışınının yolu kırmızı noktalı bir çizgi ile işaretlenmiştir.
MP'lerin in vitro görünürlüğü belirlendikten sonra, bunların bir alt kümesi, vahşi tip dişi Wistar albino fareleri (~12 haftalık, ~200 g) üzerinde in vivo olarak test edildi.Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japonya), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonya) ve butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Sıçanlara Pharma (Japonya) karışımı intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi uygulandı.Anestezi sonrası trakea çevresindeki tüyler alınarak endotrakeal tüp (ET; 16 Ga intravenöz kanül, Terumo BCT) yerleştirilerek ve termal torba içeren özel yapım bir görüntüleme plakası üzerinde sırtüstü pozisyonda immobilize edilerek görüntüleme için hazırlandı. vücut ısısını korumak için.22. Görüntüleme plakası daha sonra Şekil 2a'da gösterildiği gibi trakeayı x-ışını görüntüsü üzerinde yatay olarak hizalamak için görüntüleme kutusundaki numune aşamasına hafif bir açıyla tutturulmuştur.
(a) SPring-8 görüntüleme ünitesinde in vivo görüntüleme kurulumu, X-ışını ışını yolu kırmızı noktalı çizgi ile işaretlenmiştir.(b,c) Trakeal mıknatıs lokalizasyonu, dikey olarak monte edilmiş iki IP kamera kullanılarak uzaktan gerçekleştirildi.Ekrandaki görüntünün sol tarafında, kafayı tutan tel halkayı ve ET tüpünün içine yerleştirilmiş iletme kanülünü görebilirsiniz.
100 ul cam şırınga kullanan bir uzaktan kumandalı şırınga pompası sistemi (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), 30 Ga iğne kullanılarak bir PE10 tüpüne (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) bağlandı.Endotrakeal tüpü yerleştirirken ucun trakeada doğru konumda olduğundan emin olmak için tüpü işaretleyin.Mikro pompa kullanılarak şırınga pistonu çıkarıldı ve tüpün ucu iletilecek MP örneğine daldırıldı.Dolu iletim tüpü daha sonra endotrakeal tüpün içine yerleştirildi ve ucu beklenen uygulanan manyetik alanımızın en güçlü kısmına yerleştirildi.Görüntü alma, Arduino tabanlı zamanlama kutumuza bağlı bir nefes detektörü kullanılarak kontrol edildi ve tüm sinyaller (örn. sıcaklık, solunum, deklanşör açma/kapama ve görüntü alma) Powerlab ve LabChart (AD Instruments, Sidney, Avustralya) kullanılarak kaydedildi. 22 Görüntüleme Sırasında Muhafaza mevcut olmadığında, iki IP kamera (Panasonic BB-SC382) birbirine yaklaşık 90° açıyla yerleştirildi ve görüntüleme sırasında mıknatısın trakeaya göre konumunu kontrol etmek için kullanıldı (Şekil 2b, c).Hareket artefaktlarını en aza indirmek için, terminal solunum akışı platosu sırasında nefes başına bir görüntü elde edildi.
Mıknatıs, görüntüleme gövdesinin dışında uzaktan konumlandırılabilen ikinci aşamaya takılır.Mıknatısın çeşitli pozisyonları ve konfigürasyonları test edildi, bunlar arasında: trakeanın yaklaşık 30° yukarısına yerleştirilmiş (konfigürasyonlar Şekil 2a ve 3a'da gösterilmektedir);bir mıknatıs hayvanın üstünde ve diğeri altında, kutupları çekim için ayarlanmıştır (Şekil 3b)., kutupları itme için ayarlanan (Şekil 3c) hayvanın üstünde ve altında bir mıknatıs ve trakeanın üstünde ve dik bir mıknatıs (Şekil 3d).Hayvanı ve mıknatısı kurduktan ve test edilen MP'yi şırınga pompasına yükledikten sonra, görüntülerin alınması üzerine 4 µl/sn hızında 50 µl'lik bir doz verin.Mıknatıs daha sonra görüntü almaya devam ederken trakea boyunca veya boyunca ileri geri hareket ettirilir.
İn vivo görüntüleme için mıknatıs konfigürasyonu (a) trakeanın üzerinde yaklaşık 30°'lik bir açıda bir mıknatıs, (b) çekim için yapılandırılmış iki mıknatıs, (c) itme için yapılandırılmış iki mıknatıs, (d) trakeanın üzerinde ve dik bir mıknatıs trakea.Gözlemci, trakea yoluyla ağızdan akciğerlere doğru baktı ve X-ışını ışını farenin sol tarafından geçerek sağ tarafından çıktı.Mıknatıs ya hava yolu boyunca hareket ettirilir ya da X-ışını ışını yönünde trakeanın sağına ve soluna hareket ettirilir.
Ayrıca solunum ve kalp atış hızının karışmadığı durumlarda hava yollarındaki parçacıkların görünürlüğünü ve davranışını belirlemeye çalıştık.Bu nedenle, görüntüleme süresinin sonunda, hayvanlara aşırı dozda pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, ABD; ~65 mg/kg ip) nedeniyle insanca ötenazi uygulandı.Bazı hayvanlar görüntüleme platformunda bırakıldı ve solunum ve kalp atışının kesilmesinden sonra görüntüleme işlemi tekrarlandı ve hava yolu yüzeyinde MP görünmüyorsa ek bir MP dozu eklendi.
Ortaya çıkan görüntüler düz ve karanlık alan için düzeltildi ve ardından MATLAB'da (R2020a, The Mathworks) yazılmış özel bir komut dosyası kullanılarak bir filmde birleştirildi (saniyede 20 kare; 15–25 × solunum hızına bağlı olarak normal hız).
LV gen vektör iletimi ile ilgili tüm çalışmalar, Adelaide Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Araştırma Merkezi'nde gerçekleştirildi ve SPring-8 deneyinin sonuçlarını, manyetik alan varlığında LV-MP iletiminin in vivo gen transferini artırıp artıramayacağını değerlendirmek için kullanmayı amaçladı. .MF ve manyetik alanın etkilerini değerlendirmek için iki grup hayvan tedavi edildi: bir gruba mıknatıs yerleştirmeli LV MF enjekte edildi ve diğer gruba mıknatıssız LV MF ile bir kontrol grubu enjekte edildi.
LV gen vektörleri, daha önce açıklanan yöntemler 25, 26 kullanılarak üretilmiştir.LacZ vektörü, akciğer dokusunun ön kısımlarında ve bölümlerinde görülebilen transdükte hücrelerde mavi bir reaksiyon ürünü üreten MPSV kurucu promotörü (LV-LacZ) tarafından sürülen nükleer lokalize bir beta-galaktosidaz genini ifade eder.Titrasyon, TU/ml cinsinden titreyi hesaplamak için bir hemasitometre kullanılarak LacZ-pozitif hücrelerin sayısının manuel olarak sayılmasıyla hücre kültürlerinde gerçekleştirildi.Taşıyıcılar -80°C'de dondurularak saklanır, kullanımdan önce eritilir ve 1:1 oranında karıştırılarak ve teslimattan önce en az 30 dakika buz üzerinde inkübe edilerek CombiMag'e bağlanır.
Normal Sprague Dawley fareleri (n = 3/grup, ~2-3, 1 aylıkken 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Avustralya) ve 60 mg/kg ketamin (Ilium, Avustralya) karışımı ile ip anestezi uygulanmış) ip ) 16 Ga intravenöz kanül ile enjeksiyon ve cerrahi olmayan oral kanülasyon.Trakeal hava yolu dokusunun LV iletimini almasını sağlamak için, trakeal hava yolu yüzeyinin bir tel sepetle (N-Circle, nitinol taş çıkarıcı NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, ABD) 30 s28.Daha sonra biyogüvenlik kabinindeki pertürbasyondan yaklaşık 10 dakika sonra trakeal LV-MP uygulaması gerçekleştirildi.
Bu deneyde kullanılan manyetik alan, aynı mıknatısların damıtma stent kelepçeleriyle trakea üzerinde tutulduğu (Şekil 4) bir in vivo röntgen çalışmasına benzer şekilde yapılandırıldı.Daha önce tarif edildiği gibi jel uçlu bir pipet kullanılarak trakeaya (n = 3 hayvan) 50 ul hacimde (2 x 25 ul alikot) LV-MP verildi.Kontrol grubu (n = 3 hayvan) aynı LV-MP'yi mıknatıs kullanmadan aldı.İnfüzyon tamamlandıktan sonra kanül endotrakeal tüpten çıkarılır ve hayvan ekstübe edilir.Mıknatıs, çıkarılmadan önce 10 dakika yerinde kalır.Sıçanlara deri altından meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Avustralya) verildi, ardından intraperitoneal 1 mg/kg atipamazol hidroklorür (Antisedan, Zoetis, Avustralya) enjeksiyonu ile anestezi kesildi.Sıçanlar sıcak tutuldu ve anesteziden tamamen iyileşene kadar gözlendi.
Biyolojik güvenlik kabininde LV-MP dağıtım cihazı.ET tüpünün açık gri Luer-lock kılıfının ağızdan çıktığını ve şekilde gösterilen jel pipet ucunun ET tüpünden trakeaya istenen derinliğe sokulduğunu görebilirsiniz.
LV-MP uygulama prosedüründen bir hafta sonra, hayvanlar %100 CO2 inhalasyonu yoluyla insanca öldürüldü ve standart X-gal tedavimiz kullanılarak LacZ ekspresyonu değerlendirildi.En kaudal üç kıkırdak halkası, endotrakeal tüpün yerleştirilmesinden kaynaklanan herhangi bir mekanik hasar veya sıvı tutulmasının analize dahil edilmemesini sağlamak için çıkarıldı.Her trakea, analiz için iki yarım elde etmek üzere uzunlamasına kesildi ve lümen yüzeyini görselleştirmek için bir Minutien iğnesi (Fine Science Tools) kullanılarak silikon kauçuk (Sylgard, Dow Inc) içeren bir bardağa yerleştirildi.Dönüştürülen hücrelerin dağılımı ve karakteri, bir DigiLite kamera ve TCapture yazılımı (Tucsen Photonics, Çin) ile bir Nikon mikroskobu (SMZ1500) kullanılarak önden fotoğraflanarak doğrulandı.Görüntüler 20x büyütmede (trakeanın tam genişliği için maksimum ayar dahil) elde edildi, trakeanın tüm uzunluğu adım adım görüntülendi ve görüntülerin "dikilmesine" izin vermek için her görüntü arasında yeterli örtüşme sağlandı.Her trakeadan alınan görüntüler daha sonra düzlemsel hareket algoritması kullanılarak Composite Image Editor sürüm 2.0.3 (Microsoft Research) kullanılarak tek bir bileşik görüntüde birleştirildi. Her bir hayvanın trakeal bileşik görüntüleri içindeki LacZ ifadesinin alanı, daha önce açıklandığı gibi28, 0,35 < Ton < 0,58, Doygunluk > 0,15 ve Değer < 0,7 ayarları kullanılarak otomatik bir MATLAB komut dosyası (R2020a, MathWorks) kullanılarak ölçüldü. Her hayvanın trakeal bileşik görüntüleri içindeki LacZ ifadesinin alanı, daha önce açıklandığı gibi28, 0,35 < Ton < 0,58, Doygunluk > 0,15 ve Değer < 0,7 ayarları kullanılarak otomatik bir MATLAB komut dosyası (R2020a, MathWorks) kullanılarak ölçüldü. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Her hayvandan alınan kompozit trakeal görüntülerdeki LacZ ekspresyon alanı, daha önce açıklandığı gibi28 0.35 ayarları kullanılarak otomatik bir MATLAB komut dosyası (R2020a, MathWorks) kullanılarak ölçüldü.0,15 ve değer<0 ,7.如 前所 述 ， 使用 Matlab 脚本 （R2020A ， Mathworks） 对 每 只 动物 气管 进行 进行 进行 进行 进行 ， ， 中 使用 使用 使用 只 <0.58 、 饱和度> 0.15 和值 <0.7如 前所 述 ， 自动 Matlab 脚本 （（R2020A ， Mathworks） 来自 每 只 的 复合 图像 使用 使用 使用 的 的 表达 量化 量化 ， ， ， 使用 量化 量化 量化 量化 、 、 、 、 、> 0.15 和值 <0.7 的 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 .................... BELKİ Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Her hayvanın trakeasının bileşik görüntüleri üzerindeki LacZ ifade alanları, daha önce tarif edildiği gibi 0.35 < hue < 0.58, doygunluk > 0.15 ve değer < 0.7 ayarları kullanılarak otomatik bir MATLAB komut dosyası (R2020a, MathWorks) kullanılarak ölçüldü.GIMP v2.10.24'te doku konturları izlenerek, doku alanını tanımlamak ve trakeal doku dışında herhangi bir yanlış algılamayı önlemek için her bileşik görüntü için manuel olarak bir maske oluşturuldu.Her bir hayvanın tüm bileşik görüntülerinden alınan lekeli alanlar, o hayvan için toplam lekeli alanı vermek üzere toplandı.Boyalı alan daha sonra normalleştirilmiş bir alan elde etmek için maskenin toplam alanına bölündü.
Her trakea parafine gömüldü ve 5 um kalınlığında kesitler alındı.Kesitler, 5 dakika boyunca nötr hızlı kırmızı ile zıt boyamaya tabi tutuldu ve görüntüler bir Nikon Eclipse E400 mikroskobu, DS-Fi3 kamera ve NIS eleman yakalama yazılımı (sürüm 5.20.00) kullanılarak elde edildi.
Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism v9'da (GraphPad Software, Inc.) yapıldı.İstatistiksel anlamlılık, p ≤ 0.05 olarak ayarlandı.Normallik, Shapiro-Wilk testi kullanılarak test edildi ve LacZ boyamasındaki farklılıklar, eşleştirilmemiş bir t testi kullanılarak değerlendirildi.
Tablo 1'de açıklanan altı MP, PCXI tarafından incelendi ve görünürlük, Tablo 2'de açıklanmıştır. İki polistiren MP (MP1 ve MP2; sırasıyla 18 µm ve 0,25 µm) PCXI tarafından görülmedi, ancak kalan numuneler tanımlanabildi (örnekler Şekil 5'te gösterilmiştir).MP3 ve MP4 zayıf bir şekilde görünür (sırasıyla %10-15 Fe3O4; 0,25 µm ve 0,9 µm).MP5 (%98 Fe3O4; 0,25 µm) test edilen en küçük parçacıklardan bazılarını içermesine rağmen, en belirgin olanıydı.CombiMag MP6 ürününü ayırt etmek zordur.Her durumda, mıknatısı kapilere paralel olarak ileri geri hareket ettirerek MF'leri tespit etme yeteneğimiz büyük ölçüde geliştirildi.Mıknatıslar kılcal damardan uzaklaştıkça, parçacıklar uzun zincirler halinde dışarı çekildi, ancak mıknatıslar yaklaştıkça ve manyetik alan kuvveti arttıkça, parçacıklar kılcalın üst yüzeyine doğru göç ettikçe parçacık zincirleri kısaldı (bkz. Ek Video S1 : MP4), yüzeydeki parçacık yoğunluğunu arttırır.Tersine, mıknatıs kılcal damardan çıkarıldığında alan kuvveti azalır ve MP'ler kılcalın üst yüzeyinden uzanan uzun zincirler halinde yeniden düzenlenir (bkz. Ek Video S2: MP4).Mıknatısın hareketi durduktan sonra, parçacıklar denge konumuna ulaştıktan sonra bir süre hareket etmeye devam eder.MP, kılcalın üst yüzeyine doğru ve buradan uzağa doğru hareket ettikçe, manyetik parçacıklar sıvının içinden birikintileri çekme eğilimi gösterir.
MP'nin PCXI altında görünürlüğü örnekler arasında önemli ölçüde değişir.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ve (d) MP6.Burada gösterilen tüm görüntüler, doğrudan kılcal damarın yaklaşık 10 mm üzerine yerleştirilmiş bir mıknatısla çekilmiştir.Görünen büyük daireler, faz kontrast görüntüsünün siyah ve beyaz kenar özelliklerini açıkça gösteren, kılcal damarlarda hapsolmuş hava kabarcıklarıdır.Kırmızı kutu, kontrastı artıran büyütmeyi gösterir.Tüm şekillerdeki mıknatıs devrelerinin çaplarının ölçekli olmadığına ve gösterilenden yaklaşık 100 kat daha büyük olduğuna dikkat edin.
Mıknatıs kılcal damarın üst kısmı boyunca sola ve sağa hareket ettikçe, MP dizisinin açısı mıknatısla hizalanacak şekilde değişir (bkz. Şekil 6), böylece manyetik alan çizgileri çizilir.MP3-5 için, akor eşik açısına ulaştıktan sonra, parçacıklar kapilerin üst yüzeyi boyunca sürüklenirler.Bu genellikle MP'lerin manyetik alanın en güçlü olduğu yerin yakınında daha büyük gruplar halinde kümelenmesine neden olur (bkz. Ek Video S3: MP5).Bu ayrıca, MP'nin sıvı-hava arayüzünde toplanmasına ve konsantre olmasına neden olan kılcal damarın ucuna yakın görüntüleme yapıldığında özellikle belirgindir.MP3-5'tekilere göre ayırt edilmesi daha zor olan MP6'daki parçacıklar, mıknatıs kılcal damar boyunca hareket ettiğinde sürüklenmedi, ancak MP telleri ayrışarak parçacıkları görünürde bıraktı (bkz. Ek Video S4: MP6).Bazı durumlarda, uygulanan manyetik alan, mıknatısı görüntüleme bölgesinden uzun bir mesafeye hareket ettirerek azaltıldığında, kalan MP'ler yerçekimi ile yavaşça tüpün alt yüzeyine indi ve ipte kaldı (bkz. Ek Video S5: MP3) .
Mıknatıs kapilerin üzerinde sağa doğru hareket ettikçe MP dizisinin açısı değişir.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ve (d) MP6.Kırmızı kutu, kontrastı artıran büyütmeyi gösterir.Bu statik görüntülerde görselleştirilemeyen önemli parçacık yapısını ve dinamik bilgileri ortaya koydukları için ek videoların bilgilendirme amaçlı olduğunu lütfen unutmayın.
Testlerimiz, mıknatısı trakea boyunca yavaşça ileri geri hareket ettirmenin, in vivo karmaşık hareket bağlamında MF'nin görselleştirilmesini kolaylaştırdığını göstermiştir.Polistiren boncuklar (MP1 ve MP2) kılcal damarda görünmediğinden hiçbir in vivo test yapılmadı.Kalan dört MF'nin her biri, mıknatısın uzun ekseni trakea üzerinde dikeyle yaklaşık 30°'lik bir açıda konumlandırılarak in vivo olarak test edildi (bakınız Şekil 2b ve 3a), çünkü bu daha uzun MF zincirleriyle sonuçlandı ve daha etkiliydi. bir mıknatıstan daha.yapılandırma sonlandırıldı.MP3, MP4 ve MP6 hiçbir canlı hayvanın trakeasında bulunmamıştır.Hayvanları insanca öldürdükten sonra farelerin solunum yollarını görselleştirirken, bir şırınga pompası kullanılarak ek hacim eklendiğinde bile parçacıklar görünmez kaldı.MP5 en yüksek demir oksit içeriğine sahipti ve tek görünür parçacıktı, dolayısıyla MP davranışını in vivo olarak değerlendirmek ve karakterize etmek için kullanıldı.
Mıknatısın MF yerleştirilmesi sırasında trakea üzerine yerleştirilmesi, MF'lerin hepsi olmasa da birçoğunun görüş alanında yoğunlaşmasına neden oldu.Parçacıkların trakeal girişi en iyi insanca ötenazi uygulanan hayvanlarda gözlenir.Şekil 7 ve Ek Video S6: MP5, ventral trakeanın yüzeyindeki parçacıkların hızlı manyetik olarak yakalanmasını ve hizalanmasını gösterir; bu, MP'lerin trakeanın istenen bölgelerine hedeflenebileceğini gösterir.MF verilmesinden sonra trakea boyunca daha distal olarak arama yapıldığında, bazı MF'ler karinaya daha yakın bulundu; bu, sıvı uygulaması sırasında maksimum manyetik alan kuvveti bölgesinden iletildiklerinden, tüm MF'leri toplamak ve tutmak için yetersiz manyetik alan kuvvetini gösterir.işlem.Bununla birlikte, doğum sonrası MP konsantrasyonları, görüntü alanı çevresinde daha yüksekti; bu, birçok MP'nin, uygulanan manyetik alan gücünün en yüksek olduğu hava yolu bölgelerinde kaldığını düşündürür.
Yakın zamanda ötenazi uygulanan bir farenin trakeasına MP5 verilmesinden önce ve (b) sonrasına ait (a) görüntüleri, görüntüleme alanının hemen üzerine yerleştirilmiş bir mıknatıs ile.Tasvir edilen alan iki kıkırdaklı halka arasında yer almaktadır.MP verilmeden önce hava yollarında bir miktar sıvı vardır.Kırmızı kutu, kontrastı artıran büyütmeyi gösterir.Bu görüntüler S6: MP5 Ek Video'da yer alan videodan alınmıştır.
Mıknatısın in vivo olarak trakea boyunca hareket ettirilmesi, hava yolu yüzeyindeki MP zincirinin açısında, kılcal damarlarda gözlenene benzer bir değişiklikle sonuçlandı (bkz. Şekil 8 ve Ek Video S7: MP5).Bununla birlikte, çalışmamızda, kılcal damarların yapabildiği gibi, MP'ler canlı solunum yollarının yüzeyi boyunca sürüklenemedi.Bazı durumlarda, mıknatıs sola ve sağa hareket ettikçe MP zinciri uzar.İlginç bir şekilde, mıknatıs trakea boyunca boylamasına hareket ettirildiğinde parçacık zincirinin sıvının yüzey tabakasının derinliğini değiştirdiğini ve mıknatıs doğrudan üstten hareket ettirildiğinde ve parçacık zinciri dikey bir konuma döndürüldüğünde genişlediğini de bulduk (bkz. Ek Video S7).: MP5, 0:09'da, sağ alt).Karakteristik hareket paterni, mıknatıs trakeanın üst kısmı boyunca yanal olarak hareket ettirildiğinde değişti (yani, trakeanın uzunluğu boyunca değil, hayvanın soluna veya sağına).Parçacıklar hareketleri sırasında hala açıkça görülüyordu, ancak mıknatıs trakeadan çıkarıldığında parçacık dizilerinin uçları görünür hale geldi (bkz. Ek Video S8: MP5, 0:08'den itibaren).Bu, bir cam kapilerde uygulanan bir manyetik alanın etkisi altında manyetik alanın gözlenen davranışına uygundur.
Canlı anestezi uygulanmış bir sıçanın trakeasında MP5'i gösteren örnek görüntüler.(a) Mıknatıs, trakeanın yukarısında ve solunda görüntü elde etmek için kullanılır, ardından (b) mıknatısı sağa hareket ettirdikten sonra.Kırmızı kutu, kontrastı artıran büyütmeyi gösterir.Bu görüntüler, S7'nin Ek Videosu: MP5'te yer alan videodan alınmıştır.
İki kutup, trakeanın üstünde ve altında kuzey-güney doğrultusunda ayarlandığında (yani, çekerek; Şekil 3b), MP akorları daha uzun göründü ve trakeanın dorsal yüzeyinden ziyade trakeanın yan duvarında konumlandı. trakea (bkz. Ek).Video S9:MP5).Bununla birlikte, genellikle tek mıknatıslı bir cihazla ortaya çıkan ikili mıknatıslı bir cihaz kullanılarak sıvı uygulamasından sonra bir bölgede (yani, trakeanın dorsal yüzeyi) yüksek partikül konsantrasyonları saptanmadı.Daha sonra, bir mıknatıs zıt kutupları itecek şekilde yapılandırıldığında (Şekil 3c), görüş alanında görünen parçacıkların sayısı teslimattan sonra artmadı.Mıknatısları sırasıyla çeken veya iten yüksek manyetik alan kuvveti nedeniyle her iki mıknatıs konfigürasyonunun ayarlanması zordur.Kurulum daha sonra hava yollarına paralel olan ancak hava yollarından 90 derecelik bir açıyla geçen tek bir mıknatıs olarak değiştirildi, böylece kuvvet çizgileri trakeal duvarı ortogonal olarak geçti (Şekil 3d). yan duvar.gözlemlenmekAncak bu konfigürasyonda, tanımlanabilir bir MF biriktirme hareketi veya mıknatıs hareketi yoktu.Tüm bu sonuçlara dayanarak, gen taşıyıcılarının in vivo çalışmaları için tek bir mıknatıs ve 30 derecelik bir yönelime sahip bir konfigürasyon seçildi (Şekil 3a).
Hayvan, insanca kurban edildikten hemen sonra birçok kez görüntülendiğinde, karışan doku hareketinin olmaması, mıknatısın öteleme hareketine uygun olarak "sallanan", net kıkırdaklar arası alanda daha ince, daha kısa parçacık çizgilerinin ayırt edilebileceği anlamına geliyordu.MP6 parçacıklarının varlığını ve hareketini net bir şekilde görün.
LV-LacZ titresi 1,8 x 108 IU/mL idi ve CombiMag MP (MP6) ile 1:1 karıştırıldıktan sonra, hayvanlara 50 µl trakeal dozda 9 x 107 IU/ml LV aracı (yani 4,5) enjekte edildi. x 106 TU/sıçan).)).Bu çalışmalarda, doğum sırasında mıknatısı hareket ettirmek yerine, LV transdüksiyonunun (a) manyetik alan yokluğunda vektör iletimine kıyasla iyileştirilip iyileştirilemeyeceğini ve (b) hava yolunun iyileştirilip iyileştirilemeyeceğini belirlemek için mıknatısı tek bir pozisyonda sabitledik. odaklanmak.Hücreler, üst solunum yolunun manyetik hedef bölgelerinde transdükte ediliyor.
Mıknatısların varlığı ve CombiMag'in LV vektörleriyle kombinasyon halinde kullanılması, standart LV vektör verme protokolümüzde olduğu gibi, hayvan sağlığını olumsuz yönde etkiliyor gibi görünmedi.Mekanik bozulmaya maruz kalan trakeal bölgenin önden görüntüleri (Ek Şekil 1), LV-MP ile tedavi edilen grubun bir mıknatıs varlığında önemli ölçüde daha yüksek transdüksiyon seviyelerine sahip olduğunu gösterdi (Şekil 9a).Kontrol grubunda sadece az miktarda mavi LacZ boyanması mevcuttu (Şekil 9b).X-Gal ile boyanmış normalleştirilmiş bölgelerin miktarının belirlenmesi, bir manyetik alan varlığında LV-MP uygulamasının yaklaşık 6 kat iyileşme ile sonuçlandığını gösterdi (Şekil 9c).
Manyetik alan varlığında ve (b) mıknatıs yokluğunda LV-MP (a) ile trakeal transdüksiyonu gösteren bileşik görüntü örneği.(c) Bir mıknatıs kullanılarak trakeada LacZ transdüksiyonunun normalize edilmiş alanında istatistiksel olarak anlamlı iyileşme (*p = 0.029, t-testi, grup başına n = 3, ortalama ± ortalamanın standart hatası).
Nötr hızlı kırmızı lekeli bölümler (Ek Şekil 2'de gösterilen örnek), LacZ lekeli hücrelerin daha önce bildirildiği gibi aynı numunede ve aynı yerde bulunduğunu gösterdi.
Hava yolu gen tedavisindeki temel zorluk, taşıyıcı partiküllerin ilgi alanlarındaki kesin lokalizasyonu ve hava akımı ve aktif mukus klirensi varlığında mobil akciğerde yüksek düzeyde transdüksiyon etkinliğinin elde edilmesi olmaya devam etmektedir.Kistik fibrozda solunum yolu hastalıklarının tedavisine yönelik LV taşıyıcıları için, taşıyıcı parçacıkların iletken hava yollarında kalış süresinin arttırılması şimdiye kadar ulaşılamaz bir hedef olmuştur.Castellani ve diğerleri tarafından işaret edildiği gibi, transdüksiyonu artırmak için manyetik alanların kullanılması elektroporasyon gibi diğer gen verme yöntemlerine göre avantajlara sahiptir çünkü basitliği, ekonomiyi, lokalize iletimi, artan etkinliği ve daha kısa inkübasyon süresini bir araya getirebilir.ve muhtemelen daha düşük bir araç dozu10.Bununla birlikte, harici manyetik kuvvetlerin etkisi altında hava yollarında manyetik partiküllerin in vivo birikmesi ve davranışı hiçbir zaman tarif edilmemiştir ve aslında bu yöntemin bozulmamış canlı hava yollarında gen ekspresyon seviyelerini artırma yeteneği in vivo olarak gösterilmemiştir.
PCXI senkrotronu üzerindeki in vitro deneylerimiz, MP polistiren dışında test ettiğimiz tüm parçacıkların kullandığımız görüntüleme düzeneğinde görünür olduğunu gösterdi.Bir manyetik alanın varlığında, manyetik alanlar, uzunlukları parçacıkların türü ve manyetik alanın gücü (yani, mıknatısın yakınlığı ve hareketi) ile ilişkili olan diziler oluşturur.Şekil 10'da gösterildiği gibi, gözlemlediğimiz sicimler, her bir parçacık manyetize olurken ve kendi yerel manyetik alanını indüklerken oluşur.Bu ayrı alanlar, diğer parçacıkların yerel çekim güçlerinden ve diğer parçacıkların itme kuvvetlerinden kaynaklanan yerel kuvvetler nedeniyle diğer benzer parçacıkların toplanmasına ve grup sicim hareketleriyle bağlanmasına neden olur.
(a, b) sıvı dolu kılcal damarların içinde oluşan parçacık zincirlerini ve (c, d) hava dolu bir trakeayı gösteren diyagram.Kılcal damarların ve trakeanın ölçeğe göre çizilmediğine dikkat edin.Panel (a) ayrıca zincirler halinde düzenlenmiş Fe3O4 partiküllerini içeren MF'nin bir tanımını içerir.
Mıknatıs kılcal boru üzerinde hareket ettiğinde, parçacık dizisinin açısı Fe3O4 içeren MP3-5 için kritik eşiğe ulaştı, bundan sonra parçacık dizisi artık orijinal konumunda kalmadı, yüzey boyunca yeni bir konuma taşındı.mıknatıs.Bu etki muhtemelen, cam kılcalın yüzeyinin bu hareketin oluşmasına izin verecek kadar pürüzsüz olmasından kaynaklanmaktadır.İlginç bir şekilde, MP6 (CombiMag) bu şekilde davranmadı, belki de parçacıkların daha küçük olması, farklı bir kaplamaya veya yüzey yüküne sahip olması veya tescilli taşıyıcı sıvının hareket etme yeteneklerini etkilemesi nedeniyle.CombiMag parçacık görüntüsündeki kontrast da daha zayıftır, bu da sıvının ve parçacıkların aynı yoğunluğa sahip olabileceğini ve bu nedenle kolayca birbirlerine doğru hareket edemeyeceklerini düşündürür.Mıknatıs çok hızlı hareket ederse parçacıklar da sıkışabilir, bu da manyetik alan kuvvetinin sıvıdaki parçacıklar arasındaki sürtünmeyi her zaman yenemeyeceğini gösterir, bu da manyetik alan kuvvetinin ve mıknatıs ile hedef alan arasındaki mesafenin aynı şekilde gelmemesi gerektiğini düşündürür. sürpriz.önemli.Bu sonuçlar ayrıca, mıknatısların hedef bölgeden akan birçok mikro partikülü yakalayabilmesine rağmen, CombiMag partiküllerini trakea yüzeyi boyunca hareket ettirmek için mıknatıslara güvenilemeyeceğini göstermektedir.Bu nedenle, in vivo LV MF çalışmalarının, hava yolu ağacının belirli alanlarını fiziksel olarak hedeflemek için statik manyetik alanlar kullanması gerektiği sonucuna vardık.
Parçacıklar vücuda verildikten sonra, vücudun karmaşık hareketli dokusu bağlamında tespit edilmeleri zordur, ancak MP tellerini "kıpırdatmak" için mıknatısın trakea üzerinde yatay olarak hareket ettirilmesiyle tespit yetenekleri geliştirilmiştir.Gerçek zamanlı görüntüleme mümkün olsa da, hayvan insanca öldürüldükten sonra parçacık hareketini ayırt etmek daha kolay.Mıknatıs görüntüleme alanı üzerine yerleştirildiğinde MP konsantrasyonları genellikle bu konumda en yüksekti, ancak bazı parçacıklar genellikle trakeanın daha aşağısında bulunuyordu.İn vitro çalışmalardan farklı olarak, partiküller bir mıknatısın hareketiyle trakeadan aşağı sürüklenemez.Bu bulgu, trakea yüzeyini kaplayan mukusun tipik olarak inhale edilen partikülleri nasıl işlediği, mukus içinde hapsedip daha sonra muko-siliyer temizleme mekanizması yoluyla temizlediği ile tutarlıdır.
Çekim için trakeanın üstünde ve altında mıknatıs kullanmanın (Şekil 3b), bir noktada oldukça yoğun olan ve potansiyel olarak parçacıkların daha düzgün dağılımına yol açan bir manyetik alandan ziyade daha düzgün bir manyetik alanla sonuçlanabileceğini varsaydık..Ancak, ön çalışmamız bu hipotezi destekleyecek net bir kanıt bulamadı.Benzer şekilde, bir çift mıknatısı itecek şekilde ayarlamak (Şekil 3c), görüntü alanında daha fazla partikül birikmesine neden olmadı.Bu iki bulgu, çift mıknatıs kurulumunun MP işaretlemesinin yerel kontrolünü önemli ölçüde iyileştirmediğini ve ortaya çıkan güçlü manyetik kuvvetlerin ayarlanmasının zor olduğunu ve bu yaklaşımı daha az pratik hale getirdiğini göstermektedir.Benzer şekilde, mıknatısı trakeanın yukarısına ve karşısına yönlendirmek de (Şekil 3d), görüntülenen alanda kalan parçacıkların sayısını artırmadı.Bu alternatif konfigürasyonlardan bazıları, biriktirme bölgesindeki manyetik alan kuvvetinde bir azalmaya neden oldukları için başarılı olmayabilir.Bu nedenle, 30 derecedeki tek mıknatıs konfigürasyonu (Şekil 3a), en basit ve en verimli in vivo test yöntemi olarak kabul edilir.
LV-MP çalışması, LV vektörleri CombiMag ile birleştirildiğinde ve bir manyetik alan varlığında fiziksel olarak rahatsız edildikten sonra verildiğinde, kontrollere kıyasla trakeada transdüksiyon seviyelerinin önemli ölçüde arttığını gösterdi.Sinkrotron görüntüleme çalışmaları ve LacZ sonuçlarına dayanarak, manyetik alanın LV'yi trakeada tutabildiği ve hemen akciğerin derinliklerine nüfuz eden vektör partiküllerinin sayısını azaltabildiği görüldü.Bu tür hedefleme iyileştirmeleri, verilen titreleri, hedeflenmemiş transdüksiyonu, enflamatuar ve immün yan etkileri ve gen transfer maliyetlerini azaltırken daha yüksek verimliliğe yol açabilir.Daha da önemlisi, üreticiye göre CombiMag, diğer viral vektörler (AAV gibi) ve nükleik asitler dahil olmak üzere diğer gen transfer yöntemleriyle kombinasyon halinde kullanılabilir.